一種新式灌流系統(tǒng)在胞磷膽堿合成中的應(yīng)用

宋 臻

（亞翔系統(tǒng)集成科技（蘇州）股份有限公司，江蘇 蘇州 215000）

引言

胞苷二磷酸膽堿（CytidineDiphosphateCholine，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，別名胞磷膽堿或CDPC）是卵磷脂生物合成重要的中間產(chǎn)物。卵磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，它的代謝正常與否直接影響細(xì)胞的通透性、能量代謝以及蛋白質(zhì)生物合成等許多生物學(xué)功能。1963年，CDPC開(kāi)始用于臨床。實(shí)踐證明，它對(duì)腦損傷引起的意識(shí)障礙以及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有較好的療效，隨著社會(huì)的發(fā)展，CDPC更是作為預(yù)防老年癡呆的保健品得到大力的發(fā)展[1]。

圖1 CDPC分子結(jié)構(gòu)

由于CDPC的廣泛應(yīng)用，其市場(chǎng)需求量正逐步擴(kuò)大，2007年，根據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)調(diào)查，CDPC在中國(guó)市場(chǎng)的年需求大約為250 t，但當(dāng)年的供給量不足60 t，有著極大的需求缺口。因此，如何高效率、高質(zhì)量、低成本的生產(chǎn)CDPC成為企業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

將灌流系統(tǒng)應(yīng)用在CDPC生產(chǎn)中，可以大幅提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量產(chǎn)能，降低產(chǎn)品成本，進(jìn)而快速填補(bǔ)市場(chǎng)的缺口，增加企業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和企業(yè)效益。

1 胞磷膽堿的生產(chǎn)方法

1.1 胞磷膽堿生產(chǎn)方法簡(jiǎn)介

胞磷膽堿的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、雙菌發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法。化學(xué)合成法是利用化工原料，經(jīng)過(guò)逐級(jí)多步反應(yīng)，再經(jīng)提純得到最終產(chǎn)品。這種方法研發(fā)成功早，但缺點(diǎn)很多，目前只有少數(shù)企業(yè)在利用此法生產(chǎn)。90年代后日本研發(fā)成功并開(kāi)始采用酵母酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)胞磷膽堿，此法并非無(wú)菌發(fā)酵反應(yīng)，它是利用廢舊酵母的多酶體系將胞苷酸（CMP）和輔料合成CDPC，但由于當(dāng)時(shí)主要原料CMP的價(jià)格比較高，此法在當(dāng)時(shí)未得到廣泛發(fā)展。2003年以后，由于CDPC的主要原料CMP的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)成熟，CMP價(jià)格大幅下降，加之經(jīng)過(guò)優(yōu)化后轉(zhuǎn)化率大幅提高，我國(guó)開(kāi)始大量采用酵母酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)CDPC，目前市場(chǎng)大部分產(chǎn)品都由此法生產(chǎn)[2-3]。雖然成本問(wèn)題得到了解決，但酵母酶轉(zhuǎn)化法也暴露了很多新的問(wèn)題。2000年后日本開(kāi)發(fā)了雙菌發(fā)酵法，即利用大腸桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌等基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)CD PC。此法發(fā)酵工藝相對(duì)復(fù)雜，在CMP大幅降價(jià)后漸漸被淘汰。

近幾年來(lái)，隨著生物發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，酵母發(fā)酵法有了越來(lái)越大的優(yōu)勢(shì)。此法采用篩選過(guò)的高活力酵母為菌種，以CMP為原料采用無(wú)菌發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)CDPC，有菌種來(lái)源穩(wěn)定、菌種活力高、用量少、中間體雜質(zhì)少、后處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[4]。但微生物發(fā)酵周期比較長(zhǎng)，單位時(shí)間設(shè)備的產(chǎn)出比較小，需要更大的初期投入才能保證產(chǎn)能。

表1 胞磷膽堿合成方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

1.2 灌流培養(yǎng)生產(chǎn)胞磷膽堿

灌流培養(yǎng)生產(chǎn)CDPC是在酵母發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，利用特殊的設(shè)備，一方面源源不斷加入培養(yǎng)基和底物，另一方面通過(guò)重力沉淀、循環(huán)系統(tǒng)和切向過(guò)濾源源不斷提取出產(chǎn)品，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。通過(guò)此過(guò)程，可以在目前企業(yè)生產(chǎn)設(shè)備的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)少量的設(shè)備改造，極大提高CDPC的產(chǎn)能和產(chǎn)量，提高設(shè)備利用率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低產(chǎn)品的成本。

1.2.1 灌流系統(tǒng)的組成

灌流系統(tǒng)由以下幾個(gè)部分組成：補(bǔ)料系統(tǒng)、循環(huán)過(guò)濾系統(tǒng)、出料系統(tǒng)、自動(dòng)控制系統(tǒng)、其他輔助系統(tǒng)（在線清洗系統(tǒng)（CIP系統(tǒng)）和在線滅菌系統(tǒng)（SIP 系統(tǒng)））。

補(bǔ)料系統(tǒng)：向反應(yīng)釜內(nèi)補(bǔ)給發(fā)酵所需培養(yǎng)基以及CMP底物，需要無(wú)菌控制操作，由補(bǔ)料管路、補(bǔ)料罐、動(dòng)力系統(tǒng)以及輔助的CIP、SIP組成。

循環(huán)過(guò)濾系統(tǒng)：將罐內(nèi)反應(yīng)液從底部提升，通過(guò)動(dòng)力泵（隔膜泵或者蠕動(dòng)泵）經(jīng)過(guò)切向過(guò)濾的過(guò)濾器后，再回流到罐內(nèi)，通過(guò)重力沉降，切向過(guò)濾可以將料液源源不斷循環(huán)，進(jìn)而將不含細(xì)胞的反應(yīng)液導(dǎo)出反應(yīng)體系，是灌流系統(tǒng)的關(guān)鍵部分。

出料系統(tǒng)：將透過(guò)切向過(guò)濾膜的無(wú)細(xì)胞反應(yīng)液抽離反應(yīng)體系，由過(guò)濾器、動(dòng)力泵（隔膜泵或者蠕動(dòng)泵）以及配套管路，容器組成。

控制系統(tǒng)：整個(gè)系統(tǒng)的大腦，由PLC控制2臺(tái)變頻動(dòng)力泵、液位控制器、自動(dòng)隔膜閥、濁度控制器組成，一方面控制補(bǔ)料和出料的有序性，一方面保證細(xì)胞出料的清澈，保證濾膜不會(huì)過(guò)分堵塞。

其他輔助系統(tǒng)：由于整個(gè)系統(tǒng)需要在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，在中試、放大生產(chǎn)中要符合GMP等相關(guān)規(guī)范，因此還需要在線清洗系統(tǒng)、在線滅菌系統(tǒng)以及其他輔助系統(tǒng)。

圖2 灌流系統(tǒng)

1.2.2 過(guò)程和原理

初期細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞處于恢復(fù)期，此時(shí)細(xì)胞濃度比較低，代謝水平較低，主要利用葡萄糖等易利用底物進(jìn)行自身增殖，對(duì)于利用CMP產(chǎn)生CDPC的能力比較弱，一般恢復(fù)期持續(xù)的時(shí)間比較長(zhǎng)，選用有利于細(xì)胞生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基可以使細(xì)胞快速生長(zhǎng)。

進(jìn)入對(duì)數(shù)期，當(dāng)細(xì)胞積累達(dá)到一定濃度后，源源不斷的加入CMP底物，在膽堿激酶和磷酸化酶為主的酶系的作用下，CMP和含有膽堿、磷酸的底物共同作用，發(fā)生生物酶反應(yīng)，產(chǎn)生CDPC。

隨著CDPC的累計(jì)，當(dāng)摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%的時(shí)候，反應(yīng)趨于平衡，此時(shí)繼續(xù)加入CMP會(huì)使得CMP和CDPC的濃度都增加，CDPC增加的速度較慢，摩爾轉(zhuǎn)化率反而降低。此時(shí)通過(guò)灌流系統(tǒng)，將反應(yīng)液抽出，抽出后再補(bǔ)料加入培養(yǎng)基和CMP的混合底物，一方面保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，一方面可以繼續(xù)轉(zhuǎn)化生成CDPC。灌流抽出一定的CDPC溶液，并補(bǔ)加適當(dāng)量的CMP，此時(shí)CDPC轉(zhuǎn)化率會(huì)從90%立刻跌到70%左右，但由于平衡被破壞，在酶的作用下，CMP繼續(xù)反應(yīng)生成CDPC，直到再次達(dá)到平衡。

圖3 灌流系統(tǒng)

2 酵母發(fā)酵法和灌流培養(yǎng)法生產(chǎn)CDPC的實(shí)驗(yàn)比較

2.1 菌種

經(jīng)篩選過(guò)的啤酒酵母菌株LP30925（企業(yè)內(nèi)部菌種編號(hào)）。

2.1.2 培養(yǎng)基

1）酵母發(fā)酵法所用培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基1：酵母培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基2：在培養(yǎng)基1的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)配，調(diào)配后酵母濃度為3%～7%，磷酸膽堿0.5%～2%，磷酸0.5%～2%，葡萄糖10%～20%，硫酸鎂0.1%～0.5%，培養(yǎng)過(guò)程需要1～2次補(bǔ)糖，每次3%～10%。

2）灌流培養(yǎng)法所用培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基1：酵母培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基2：基本同酵母發(fā)酵法所用培養(yǎng)基2相同，葡萄糖濃度和補(bǔ)糖濃度同比降低25%～50%。

2.1.3 主要儀器和設(shè)備

DZ05A發(fā)酵罐、紫外分析儀、電泳儀（槽）、紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀。

2.1.4 培養(yǎng)方法

1）酵母發(fā)酵法：將酵母菌株加入到預(yù)先滅菌的培養(yǎng)基1中，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，10～15 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15～25 h后酵母濃度達(dá)到3%～7%，此時(shí)加入CMP、磷酸膽堿、糖等輔料，調(diào)配成培養(yǎng)基2的濃度進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)30 h左右，摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到90%以上（折算重量轉(zhuǎn)化率142%）；然后經(jīng)過(guò)機(jī)械過(guò)濾、層析柱層析、減壓濃縮、甲乙醇結(jié)晶得到成品固體CDPC。

2）灌流培養(yǎng)法：30 h前培養(yǎng)方法同酵母發(fā)酵法，反應(yīng)30 h左右，摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到90%以上 （折算重量轉(zhuǎn)化率142%）；此刻酵母濃度為9.5%以上，開(kāi)始灌流，每2 h從罐內(nèi)抽出25%體積的反應(yīng)液，并補(bǔ)入同體積含適當(dāng)CMP濃度的培養(yǎng)基，抽取補(bǔ)料過(guò)程消耗時(shí)間約20 min，剩余100 min為反應(yīng)時(shí)間，100 min后，轉(zhuǎn)化率可再次達(dá)到90%，再次循環(huán)灌流，期間酵母濃度穩(wěn)定在9.5%～11%之間，緩慢提升。灌流72～96 h后，細(xì)胞活力下降，滅菌放罐結(jié)束反應(yīng)并進(jìn)行清洗滅菌等操作。

經(jīng)試驗(yàn)，灌流培養(yǎng)在轉(zhuǎn)化率達(dá)到平衡后可以維持72～96 h，最終因?yàn)榻湍笣舛冗^(guò)高，衰亡酵母自溶產(chǎn)物過(guò)多導(dǎo)致灌流系統(tǒng)能力下降，此時(shí)考慮結(jié)束灌流培養(yǎng)，采用和舊法相同的滅活過(guò)濾方法獲得最終產(chǎn)品。

2.1.5 主要分析方法

1）酵母濃度檢測(cè)：離心管稱重，記為m1；稱取酵母發(fā)酵液樣品，計(jì)為m2，5000 r/min離心5 min后去上清，倒扣靜置1 min，擦拭離心管口的殘液后稱重，計(jì)為m3。酵母濃度根據(jù)以下公式計(jì)算：

酵母濃度C=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

此法檢測(cè)的酵母濃度為濕酵母濃度。

2）酵母摩爾轉(zhuǎn)化率快速檢測(cè)法：因?yàn)榘l(fā)酵液包含雜質(zhì)很多，對(duì)色譜柱損傷比較大，加上HPLC檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)（一般30～40 min），在生產(chǎn)中一般使用酵母摩爾轉(zhuǎn)化率快速檢測(cè)法。

取酵母發(fā)酵液樣品離心后的上清液，取樣10 μL點(diǎn)入預(yù)先制備好的四硼酸鈉—瓊脂糖電泳凝膠中，在電泳槽內(nèi)200～300 V電壓跑板3～6 min，在254 nm紫外燈下查看會(huì)出現(xiàn)清晰的兩條紫外吸收帶，其中遠(yuǎn)端為CDPC，近端為CMP，割膠（含空白），把三段凝膠分別放入裝有5 mL pH 2.0的鹽酸溶液試管中，沸水浴3～5 min融膠，靜置放冷，在280 nm紫外分光光度計(jì)下以空白為對(duì)照測(cè)量光吸收率 （非OD值），CMP和CDPC光吸收值分別為Acmp和Acdpc，轉(zhuǎn)化率根據(jù)以下公式計(jì)算：

轉(zhuǎn)化率T=Acdpc/(Acmp+Acdpc)×100%。

此法速度比藥典HPLC法一般要快10～20 min，精度和藥典HPLC法最大相差3%，適用于生產(chǎn)中間體控制，本文發(fā)酵過(guò)程的轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)是依據(jù)此法測(cè)定得出。

3）色度檢測(cè)法：色度是CDPC成品的瓶頸指標(biāo)，其主要產(chǎn)生于酵母分解產(chǎn)生的黃色色素，在過(guò)程中以測(cè)定溶液的A430作為色度指標(biāo)。取酵母發(fā)酵液樣品離心后的上清液，以純化水為對(duì)照測(cè)定A430，即為色度指標(biāo)。

4）成品收率：成品收率 =CDPC固體成品重量/投入的CMP重量 ×100%，由于發(fā)酵后段收率基本恒定，也可以用發(fā)酵液色譜定量乘以一定的損耗系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

3 結(jié)果與討論

酵母培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)至10～15 h，酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酵母濃度快速增加；15～25 h后酵母濃度達(dá)到3%～7%，此時(shí)加入CMP、磷酸膽堿、糖等輔料，調(diào)配成培養(yǎng)基2的濃度進(jìn)行反應(yīng)，酵母濃度和CDPC摩爾轉(zhuǎn)化率快速增長(zhǎng)；反應(yīng)30 h左右，酵母濃度和摩爾轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定（圖4、5）。

酵母培養(yǎng)在30 h后做滅活、放罐處理，若繼續(xù)培養(yǎng)，酵母會(huì)進(jìn)入衰亡期導(dǎo)致濃度下降，CDPC摩爾轉(zhuǎn)化率則受產(chǎn)物反饋抑制，停止增長(zhǎng)。灌流培養(yǎng)由于源源不斷補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，能維持酵母濃度的緩慢增長(zhǎng)，灌流培養(yǎng)每次分離提取掉1/4罐體積的CDPC溶液，并補(bǔ)充新的CMP底物，因?yàn)槠茐牧朔磻?yīng)平衡，使得CDPC可以繼續(xù)得到轉(zhuǎn)化。由于稀釋作用，使得CDPC轉(zhuǎn)化率曲線呈現(xiàn)鋸齒狀。72～96 h后做滅活、放罐處理。

圖4 酵母濃度—時(shí)間的關(guān)系曲線

圖5 摩爾轉(zhuǎn)化率—時(shí)間的關(guān)系曲線

從表2看出，灌流培養(yǎng)可以拉長(zhǎng)有效反應(yīng)時(shí)間，使得灌流培養(yǎng)前期種子細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間和后處理時(shí)間比重大大降低，單位時(shí)間收獲到更多的產(chǎn)品，提高了設(shè)備的利用率，灌流培養(yǎng)的產(chǎn)能是非灌流法的3.96倍，大幅降低了生產(chǎn)成本。

色度是CDPC成品的瓶頸指標(biāo)，在過(guò)程中以測(cè)定溶液的A430作為色度指標(biāo)，CDPC溶液的色度越低，表明產(chǎn)品的質(zhì)量越高。表3可以看出，酵母培養(yǎng)CDPC溶液色度質(zhì)量為0.788，灌流培養(yǎng)CDPC溶液色度質(zhì)量為0.176。灌流培養(yǎng)CDPC溶液色度（A430值）與非灌流法相比，降低了77.7%，產(chǎn)品質(zhì)量顯著提高。原因是灌流培養(yǎng)弱化了高溫滅活操作，減少了細(xì)胞破損產(chǎn)生的雜質(zhì)，使得溶液色度降低，另外純度的增加也有利于后處理收率的提高和成品質(zhì)量的提高。

4 結(jié)論

將灌流系統(tǒng)應(yīng)用在CDPC生產(chǎn)中，可以大幅提高產(chǎn)品質(zhì)量，提高產(chǎn)能，降低產(chǎn)品成本，進(jìn)而快速填補(bǔ)市場(chǎng)的缺口，增加企業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和企業(yè)效益。

表2 酵母發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法灌流培養(yǎng)產(chǎn)量和產(chǎn)能對(duì)比

表3 酵母發(fā)酵法和酵母發(fā)酵法灌流培養(yǎng)質(zhì)量（色度）對(duì)比

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