響應曲面法優(yōu)化rmHSA-GCSF的發(fā)酵工藝

單劍峰，劉曉妮，戎亞雯，張 昕，郭旺明，王同映

（杭州九源基因工程有限公司，浙江 杭州 310018）

重組人粒細胞集落因子（rhGCSF）[1]，在腫瘤放化療引起的粒細胞減少癥、再生障礙性貧血、放射病等血液病的治療及骨髓移植方面具有重要作用，但hGCSF在血漿中的半衰期較短，需要多次給藥。而人血清白蛋白（HSA）作為人體血清中的主要成分，分子量65 kD，是一種非糖基化蛋白，腎清除率非常低，對維持體內滲透壓和血漿體積起著至關重要的作用，體內半衰期為14～20 d。因此治療性蛋白和人血清白蛋白融合表達技術是長效蛋白藥物的重要技術手段之一[2]。英國葛蘭素史克公司成功開發(fā)了治療II型糖尿病的胰高血糖樣肽素-1/人血清白蛋白融合蛋白 （GLP-1/HSA,albiglutide），并于 2014年 4月獲得美國FDA批準上市[3]。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達外源蛋白是近幾十年來非常流行的方法[4]，該系統(tǒng)帶強啟動子AOX1，受甲醇嚴格調控，具有目的產物分泌表達、后續(xù)分離純化簡便等優(yōu)點。王昌梅等[5]利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功實現了rHSA-hGCSF的高效表達，通過食蟹猴體內實驗表明rHSA-hGCSF的半衰期為hGCSF單體的15～20倍。但后續(xù)研究發(fā)現hGCSF存在一個O-糖基化位點，畢赤酵母會對目標蛋白進行糖基化修飾，與哺乳動物的糖基化修飾有差異，可能產生不同的藥物蛋白代謝動力學性質，引起異常免疫反應。因此，杭州九源基因工程有限公司對rHSA-hGCSF融合蛋白進行改造和突變，成功構建出無糖基化的rmHSA-GCSF的表達載體。本文通過響應曲面分析法（RSM）來優(yōu)化rmHSA-GCSF的搖瓶表達工藝參數，并在此基礎上進行了150 L發(fā)酵罐工藝驗證，以實現rmHSA-GCSF的高效表達。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

Pichia pastoris酵母 GS115（Mut+）菌株為復旦大學李育陽教授惠贈；rmHSA-GCSF表達載體為pPIC9，由杭州九源基因工程有限公司自行構建；酵母粉購自英國OXIOD公司；YNB購自美國BD公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 種子培養(yǎng)基

YPD：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

BMGY：酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB（不含氨基酸）1.34%，1 mmol/L 磷酸鉀緩沖溶液（pH 6.0），生物素4×10-5%，甘油1%。

BMMY：酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB（不含氨基酸）1.34%，1 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液 （pH變化），生物素 4×10-5%，甲醇適量。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

基礎鹽培養(yǎng)基（FBS，Invitrogen）：H3PO4（85%）26.7 mL，CaSO4·2H2O 0.93 g，K2SO418.2 g，Mg-SO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.13 g，甘油 40 g，微量鹽溶液4.4 mL，用去離子水加至1 L。

微量鹽溶液（PTM1）：FeSO4·7H2O 65 g，ZnSO442.19 g，CuSO4·5H2O 6.0 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Co-Cl2·6H2O 0.5 g，NaMoO4·2H2O 0.2 g，NaI 0.08 g，H3BO30.02 g，生物素 0.2 g，濃硫酸 5 mL，用去離子水加至1 L，過濾除菌。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶工藝方法

將酵母菌株從甘油凍存管中劃線于YPD平板上，于30°C培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)2 d進行活化。取適量活化好的菌體接種于含50 mL BMGY的250 mL錐形瓶中，置于300 r/min、30°C搖床振蕩培養(yǎng)約24 h。再取適量培養(yǎng)好的菌懸液按一定接種量轉接至BMGY中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)好的種子液按實驗設計方案進行分裝，無菌離心，換上一定量的不同pH緩沖液的BMMY，置搖床振蕩培養(yǎng)，每隔24 h添加適量甲醇，誘導一定時間后取樣，10000 r/min 離心 1 min，留上清，-20 °C 凍存。

1.3.2 發(fā)酵工藝方法

發(fā)酵培養(yǎng)基初始體積為60 L，按5%接種量上罐，培養(yǎng)階段溫度為30°C，pH 5.0，溶氧40%。等甘油耗盡（溶氧突然躍升）即可進行甘油流加，50%甘油（含 12 mL/L PTM1）以 24 mL/(L·h)的速率進行補加適量時間，饑餓0.5 h左右，等溶氧和pH均明顯上升后，開始流加100%甲醇 （含12 mL/L PTM1）誘導，誘導條件按搖瓶優(yōu)化好的參數進行。

1.3.3 分析方法

1）蛋白電泳：參照《蛋白質技術手冊》進行[6]，濃縮膠5%，分離膠10%，考馬斯亮藍R-250染色觀察。

2）蛋白濃度測定：利用ImageMaster VDS圖像處理系統(tǒng)掃描蛋白電泳凝膠，用已知濃度的標準品做標準曲線，測定上清液中粗蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 Plackett-Burman設計法[7]

Plackett-Burman設計法是一種兩水平的試驗設計方法，它可以用最少的試驗次數使各因素的主效應得到盡可能精確的估計，從眾多考察因素中快速篩選出顯著性因素，以供進一步研究。本試驗選用實驗次數n=12的設計，對8個因素進行考察。每個因素取兩個水平，低水平“-1”為原始培養(yǎng)條件，高水平“1”取低水平的1.2～2倍，響應值為蛋白表達量（Y），采用MINITAB軟件，得到實驗設計方案（表1），并對結果分析，得到各因素效應（表 2）。

表1 Plackett-Burman實驗設計因素水平

表2 實驗結果及評價

從結果中可以看到，P值小于0.05的因素有誘導pH、甲醇添加濃度及誘導時間，表明此3種因素對rmHSA-GCSF表達有著顯著性影響，可以進入下一步響應面（RSM）實驗。

2.2 響應曲面分析優(yōu)化各影響因子

在Plackett-Burman實驗基礎上，選取誘導pH、甲醇添加濃度和誘導時間3個因素為研究對象，采用Box-Behnken實驗設計對rmHSA-GCSF表達進行3因素3水平上的響應面分析實驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。設3個因素：初始誘導 pH（X1）、甲醇添加濃度（X2）、誘導時間（X3）為自變量，rmHSA-GCSF 表達量 Y（mg/L）為響應值，利用MINITAB軟件設計了試驗方案（表3），并對實驗結果進行了分析（表4）。

表3 3因素3水平的Box-Behnken試驗設計方案

表4 Box-Behnken實驗結果

根據實驗結果，采用逐步回歸的方法進行二次回歸分析（見表5），剔除影響不顯著的因子，得到以下回歸方程式：

對該方程求極值，得到X1=5.54，X2=2.45，X3=66.4，即誘導pH為 5.54，甲醇添加濃度為2.45%，誘導時間為66.4 h，在此條件下最佳理論值為157.5 mg/L，各因素響應曲面圖見圖1，從圖中可以看出誘導pH、甲醇添加濃度和誘導時間與蛋白表達量之間的相關性。pH和誘導時間，pH和甲醇添加濃度兩者之間交互不顯著；而甲醇添加濃度和誘導時間兩者交互顯著，當誘導時間不變，甲醇添加濃度增加，蛋白表達量增大。當誘導時間62～70 h，甲醇添加濃度2.30%～2.60%時，蛋白表達量達到最佳范圍。

表5 回歸分析結果

圖1 各因素交互影響曲面圖

根據得到的優(yōu)化結果進行搖瓶驗證，rmHSAGCSF 表達量為（156.3±1.1）mg/L，與理論值偏差較小，說明本實驗范圍內建立的二次回歸模型準確有效。

2.3 150 L發(fā)酵罐工藝驗證結果

根據搖瓶工藝，指導150 L全自動發(fā)酵罐放大試驗。酵母細胞利用甘油生長菌體階段各參數基本不變，pH 5.0，溫度30°C，溶氧控制40%以上；誘導階段各參數為誘導pH 5.54，溫度30°C，甲醇初始添加濃度為2.45%，溶氧控制40%以上，誘導時間為66.4 h。通過該工藝rmHSA-GCSF得到顯著表達，表達量達600 mg/L左右，連續(xù)三批發(fā)酵的SDS-PAGE電泳結果見圖2。

3 小結

響應曲面法（RSM），是數學方法和統(tǒng)計方法相結合的產物，它包括實驗設計、建模、因子效應評估及尋求因子最佳操作條件，是用來對所感興趣的響應受多個變量影響的問題進行建模和分析，能以很少的實驗數量和時間優(yōu)化，取得明確、有目的的結論[8]。MINITAB以其簡潔的操作界面和強大的統(tǒng)計功能已經成為統(tǒng)計領域的常用方法[9]，借助該軟件，響應面分析就變得輕而易舉。

圖2 連續(xù)三批150 L罐發(fā)酵的SDS-PAGE電泳結果

由于時間及發(fā)酵罐設備等的一些原因，直接在罐上進行工藝優(yōu)化將花費大量的人力和物力，因此在搖瓶的基礎上指導上罐是必需的，本文通過在搖瓶中各參數的RSM優(yōu)化，得到一些明確的信息，如蛋白表達的最佳pH。如要達到蛋白高表達就需要延長誘導時間，但誘導時間過長，蛋白降解的風險就會增加，在此基礎上，通過分批補料的方式，成功在150 L發(fā)酵罐上放大，實現rmHSAGCSF的高效表達。

[1]何磊，于鳳波，王永峰，等．粒細胞集落刺激因子在大腸桿菌中表達的研究進展[J]．天津藥學，2011，23(2)：57-59．

[2]鄭煒，李杰．人血清白蛋白融合技術研究進展[J]．長沙大學學報，2013，27(5)：10-13．

[3]CEREGHINO J L,CREGG J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiology Reviews,2000,24(1):45-66.

[4]TRAYNOR K.Albiglutide approved for type 2 diabetes[J].American Journal of Health-System Pharmacy,2014,71(11):888.

[5]王昌梅，王同映，楊志愉，等．重組HSA-hG-CSF融合蛋白在畢赤酵母中的表達[J]．中國生物工程雜志，2006，26(12)：34-39．

[6]汪家政，范明．蛋白質技術手冊[M]．北京：科學出版社，2000．

[7]張鋒華，許煜泉，張雪洪．采用響應面分析法優(yōu)化吩嗪-1-羧酸的發(fā)酵條件[J]．現代農藥，2007，6(2)：15-18．

[8]閔亞能．實驗設計（DOE）應用指南[M]．北京：機械工業(yè)出版社，2011．

[9]王銀存，王衛(wèi)衛(wèi)，李利軍,等。響應面法優(yōu)化葡糖醋桿菌產細菌纖維素的發(fā)酵工藝[J]．中國造紙學報，2012，27(2)：45-49．