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    口腔血管瘤組織中TIP30/CC3基因的表達(dá)及意義

    2015-12-19 07:10:44陳忠輝
    關(guān)鍵詞:棕黃色胞漿期組

    陳忠輝

    (新疆兵團(tuán)第五師八十六團(tuán)南區(qū)醫(yī)院,博樂833414)

    血管瘤是由血管形成異常而引起的疾病。50%以上發(fā)生于頭頸部??谇活M面血管瘤是頜面外科常見的一種良性血管腫瘤,雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退,但是一些血管瘤病變可嚴(yán)重?fù)p壞正常組織,并產(chǎn)生并發(fā)癥[1],往往給患者及其家人帶來極大痛苦。但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機(jī)制,目前還未明了,這對于血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

    TIP30(Tat interacting protein 30)基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,抑制腫瘤血管的生成。它在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯減少,如黑色素瘤、胃癌、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等,序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因CC3基因?yàn)橥坏鞍?。近年來的研究表明,TIP30參與細(xì)胞調(diào)控,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]、抑制腫瘤新生血管生成[3]以及抑制骨橋蛋白[4]等,從而抑制腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。表明TIP30/CC3基因的表達(dá)失調(diào)與腫瘤之間存在密切關(guān)系。

    研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測了口腔血管瘤及正常周圍組織中TIP30/CC3基因表達(dá)水平,探討TIP30/CC3基因在口腔血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)變化,為臨床上治療口腔血管瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材料和方法

    1材料

    1.1 材料來源 收集新疆兵團(tuán)第五師醫(yī)院病理科2008-2013年口腔血管瘤存檔蠟塊20例,其中男性15例,女性5例。這些血管瘤所在的部位主要為頜面部。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。

    1.2 材料分組 將所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)S-P法檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),按 Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組:石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤12例,退化期血管瘤8例。另取距癌組織5cm外的周圍正常頜面部組織5例作對照。

    1.3 主要試劑 即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人TIP30/CC3單克隆抗體(購于北京中杉生物技術(shù)有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(購于福州邁新公司);DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸(購于北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

    2方法

    2.1 免疫組織化學(xué)SP法檢測TIP30/CC3和PCNA相關(guān)抗原

    具體步驟:(1)4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水;(2)抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法);(3)滴加3%H2O2,37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性;(4)正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景;(5)分別滴加一抗;(6)滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育;(7)滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色;(8)蘇木素復(fù)染;(9)梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片并鏡檢;(10)用PBS代替一抗作為陰性對照組,購買的陽性片作為TIP30/CC3的陽性對照組,人正常皮膚組織作為PCNA的陽性對照組。

    2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

    (1)TIP30/CC3以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng),PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外,應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

    (2)采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)對TIP30/CC3的表達(dá)進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。(陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%)

    3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

    結(jié) 果

    1 PCNA的表達(dá)

    增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核肥大,核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒,PCNA表達(dá)強(qiáng)(圖1);退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核扁平,胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒,PCNA表達(dá)弱(圖2)。

    2 TIP30/CC3的表達(dá)

    增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈低表達(dá)(圖3);退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈高表達(dá)(圖4);正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈高表達(dá)(圖5)。圖像分析結(jié)果見表。增生期組TIP30/CC3的表達(dá)明顯低于退化期組和正常組織(P<0.05),而后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

    討 論

    血管瘤以內(nèi)皮細(xì)胞異常增長為其特點(diǎn),血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,而血管內(nèi)皮細(xì)胞生長受制一系列正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子的調(diào)節(jié)[5-7]。一般認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因。近年來的許多研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡是血管瘤增生、消退的病理組織學(xué)基礎(chǔ),內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管瘤自然消退的關(guān)鍵所在。

    TIP30是一種30KD的Tat結(jié)合蛋白,又稱為HTATIP2 (HIV1Tat interactive protein 2),是Xiao H 等[8]通過研究人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV )的體外轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)現(xiàn)的。TIP30作為HIV轉(zhuǎn)錄的輔助因子可以和Tat結(jié)合蛋白相互結(jié)合從而提高HIV的增殖。通過序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30和腫瘤抑制基因CC3為同一蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)TIP30/CC3在多種腫瘤組織中的表達(dá)率明顯降低,如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌等,證明TIP30/CC3的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系[9-15]。其主要機(jī)制是通過抑制血管的生成和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

    表1 口腔血管瘤不同時(shí)期TIP30/CC3表達(dá)的平均光密度和陽性面積率()Table 1 The average optical density and the rate of TIP30/CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas()

    表1 口腔血管瘤不同時(shí)期TIP30/CC3表達(dá)的平均光密度和陽性面積率()Table 1 The average optical density and the rate of TIP30/CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas()

    *增生期組與退化期組比較,P<0.05;(Comparison between proliferatinghemangiomas and involuting hemangiomas)*P<0.05;△退化期組與正常組比較,P>0.05;(Comparison betweeninvoluting hemangiomas and normal skin tissue)△P>0.05;▲正常組與增生期組比較,P>0.05(Comparison between proliferatinghemangiomas and normal skin tissue) ▲P>0.05

    Groups例數(shù)N平均光密度Average Optical Density組別Rate of Positive Area 陽性面積率Involuting Group正常組 5 0.2980±0.0324▲ 0.2859±0.0318▲Normal Grou*Proliferating Group退化期組 8 0.2868±0.0323△ 0.2788±0.0316△增生期組 12 0.0804±0.0104* 0.0721±0.0103 p

    研究結(jié)果顯示:口腔血管瘤增生期組織中TIP30/CC3基因的表達(dá)明顯低于退化期血管瘤和正??谇徽衬そM織(P<0.05)。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程,是多因素、多基因發(fā)生改變所造成的。我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:抑癌基因TIP30/CC3可能通過促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡參與血管瘤的退化過程,表明TIP30表達(dá)失調(diào)可能與口腔血管瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。血管瘤是一種血管生成控制失去平衡而引起的疾病,為研究惡性腫瘤血管生成提供了一個(gè)良好的模型。血管生成是多種調(diào)節(jié)因子共同參與相互作用的結(jié)果,健康狀態(tài)下,機(jī)體通過這些因子的完美平衡來控制血管生成。研究這些因子在血管瘤形成過程中的表達(dá)可以為研究腫瘤的血管生成提供參考和指導(dǎo),通過了解這些調(diào)節(jié)因子在腫瘤血管生成中的作用,為抑制腫瘤的血管生成提供理論和方法學(xué)依據(jù)。

    因此,進(jìn)一步研究TIP30基因與血管瘤其它生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系及其相互作用機(jī)制,將有助于了解血管瘤發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制,進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。今后的實(shí)驗(yàn)中我們將進(jìn)一步探索TIP30基因在多種腫瘤組織表達(dá)降低的機(jī)制,涉及到哪些分子調(diào)控通路,并希望通過基因或蛋白水平的干預(yù)來阻斷其分子調(diào)控通路,為今后多種腫瘤的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    圖 版 說 明

    圖1 增生期血管瘤PCNA的表達(dá)

    增生的內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒(→),PCNA表達(dá)強(qiáng),S-P×200

    圖2 退化期血管瘤PCNA的表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒(→),PCNA表達(dá)弱,S-P×200

    圖3 增生期血管瘤TIP30/CC3的表達(dá)增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈低表達(dá)(→),S-P×200

    圖4 退化期血管瘤TIP30/CC3的表達(dá)退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈高表達(dá)(→),S-P×200

    圖5 正常對照組TIP30/CC3的表達(dá)正常皮膚組織內(nèi)皮細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒,TIP30/CC3呈高表達(dá)(→),S-P×200

    EXPLANATION OF FIGURES

    Fig.1PCNA expression in proliferating hemangiomas SP ×200

    Fig.2PCNA expression in involuting hemangiomas SP ×200

    Fig.3TIP30/CC3expression in proliferating hemangiomas SP×200

    Fig.4TIP30/CC3expression in involuting hemangiomas SP×200

    Fig.5TIP30/CC3expression in normal skin tissue SP ×200

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