揚子鱷、家雞及大鼠中腦TH、nNOS表達的差異比較與分析

李懷斌 吳 鋒 龔 鑫 汪仁平 熊克仁＊

（1皖南醫(yī)學院解剖學教研室，蕪湖241002；2安徽省揚子鱷繁殖研究中心，宣城242000）

揚子鱷又稱中華鱷，為兩棲卵生爬行動物，野生數(shù)量稀少，已列為國家一級重點保護動物。目前開展的主要是對揚子鱷的分子生物學及飼養(yǎng)種群的遺傳多樣性和物種保護性研究［1，2］。揚子鱷腦內(nèi)中腦較發(fā)達，中腦視葉是揚子鱷的較高級中樞［3，4］。中腦的腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）和黑質(zhì)致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）是大鼠、家雞腦干多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元較集中的分布區(qū)，酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）對DA生物合成的調(diào)節(jié)起著重要作用，經(jīng)多條途徑影響運動的調(diào)節(jié)等，具有重要的神經(jīng)生理功能［5－7］。有報道中腦VTA區(qū)神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）有助于調(diào)節(jié)TH的表達，并在腦的獎賞系統(tǒng)通路中起一定作用［8］。揚子鱷屬爬行綱，家雞屬于鳥綱，大鼠屬于哺乳綱，均屬脊椎動物門，三種動物代表著從低等到較高等的進化趨勢。因此，分析研究三種動物中腦內(nèi)TH、nNOS的表達差異，將有助于為生物進化及揚子鱷種群遺傳保護等方面的深入研究提供更多的形態(tài)學依據(jù)。本項目采用免疫組織化學染色方法結合計算機圖像分析對三種動物中腦內(nèi)TH、nNOS免疫反應陽性神經(jīng)元的分布情況和形態(tài)特征進行觀察與分析探討。

材料和方法

1.實驗動物

揚子鱷6只（體重30±5kg），家雞15只（體重1000±100g），SD大鼠15只（體重200±20g）。三種動物雌雄不拘。

2.主要試劑及儀器

TH一抗購自SIGMA公司；SABC、DAB顯色試劑盒及nNOS一抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；DHB－9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；Olympus顯微鏡（日本）；黑馬病理圖像分析儀（型號 Hema GSM－2000P，產(chǎn)地：深圳）

3.實驗方法

受揚子鱷腦取材限制，三種動物再各分三次進行實驗，即每次揚子鱷2只，家雞和SD大鼠各5只。各組動物在同一時間內(nèi)處死后，迅速取出中腦，固定于4%甲醛固定液中，固定后梯度脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋。每組每只動物中腦的相同節(jié)段分別取連續(xù)切片5張（片厚5μm）。常規(guī)脫蠟、脫水，微波熱修復，滴加TH抗體（稀釋比例為1∶1000）、nNOS抗體（稀釋比例為1∶100），采用SABC法進行染色，DAB顯色后再進行常規(guī)脫水和透明，以中性樹膠封片，利用Olympus光學顯微鏡觀察切片。

4.結果觀察

在10×10倍視野下對TH、nNOS免疫反應陽性細胞的分布部位進行觀察，利用黑馬病理圖像分析系統(tǒng)對每張切片中腦導水管周圍背側內(nèi)、外側部在10×40倍視野下進行TH、nNOS陽性細胞計數(shù)；細胞形態(tài)分類統(tǒng)計；細胞大小測定（胞體最大徑）和平均灰度值測定。將陽性細胞分為大、中、小三類：胞體最大徑＜10μm為小型細胞，胞體最大徑介于10～20μm之間為中型細胞，胞體最大徑＞21μm為大型細胞［9］。

5.統(tǒng)計學處理

三種動物各組收集數(shù)據(jù)的樣本數(shù)（揚子鱷n＝6，家雞、大鼠n＝15）。統(tǒng)計與分析采用SPSS13.0軟件。數(shù)值變量資料以表示，多組之間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗，多組間兩兩比較采用SNK－q檢驗或秩和檢驗。以α＝0.05為檢驗水準，依據(jù)P＜0.05判定有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.10×10倍視野下三種動物中腦TH、nNOS陽性神經(jīng)元共同分布部位觀察

揚子鱷中腦導水管周圍灰質(zhì)、中腦視葉、中腦被蓋等部位；家雞中腦導水管周圍灰質(zhì)、紅核、黑質(zhì)等部位；大鼠中腦導水管周圍灰質(zhì)、紅核、黑質(zhì)、中腦被蓋等部位均可見TH、nNOS陽性神經(jīng)元。本實驗三種動物均選中腦導水管周圍背側灰質(zhì)的TH、nNOS陽性神經(jīng)元進行對比觀察，其中TH陽性神經(jīng)元胞漿與胞膜呈現(xiàn)棕色或棕褐色；nNOS陽性神經(jīng)元胞漿與胞膜呈現(xiàn)棕黃色或棕色（圖1、2）。

圖1 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)TH陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×100），圖中標尺示100μmFig.1the TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×100），scale bar＝100μm

圖2 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×100），圖中標尺示100μmFig.2the nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×100），scale bar＝100μm

圖3 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)內(nèi)側部TH陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×400），圖中標尺示20μmFig.3the TH positive neuron in the medial part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

2.10×40倍視野下三種動物中腦TH、nNOS陽性神經(jīng)元的分布特征比較

揚子鱷、家雞、大鼠中腦導水管周圍背側灰質(zhì)內(nèi)、外側部均可見大、中、小型的圓形、橢圓形、梭形和多角形的TH、nNOS陽性神經(jīng)元。在揚子鱷、家雞、大鼠三者中腦導水管周圍背側灰質(zhì)的TH、nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量均呈依次增多（三組間兩兩比較P＜0.05），細胞平均灰度值依次減少（三組間兩兩比較P＜0.05），說明陽性細胞著色程度依次加深。其中對細胞大小的觀察結果為：三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)內(nèi)、外側部TH、nNOS陽性神經(jīng)元均以中型細胞為主（約占35%－50%），大型細胞以揚子鱷中腦導水管周圍背側灰質(zhì)相對較多（約占26%－28%），小型細胞所占百分比三者較接近；對細胞形態(tài)的觀察結果為：揚子鱷中腦導水管周圍背側灰質(zhì)內(nèi)、外側部TH、nNOS陽性神經(jīng)元均以橢圓形為主（約占38%－42%），家雞均以圓形為主（約占36%－38%），大鼠以橢圓形、梭形細胞為主（約占30%－33%）（表1、2，圖3－6）。

表1 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)TH陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較（）Table 1 comparison of the number and gray value of TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

表1 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)TH陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較（）Table 1 comparison of the number and gray value of TH positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

類別（kind）細胞總數(shù)（Totally number）內(nèi)側部（medial part）外側部（lateral part）灰度值（Gray value）內(nèi)側部（medial part）外側部（lateral part）揚子鱷（alligator sinensis，n＝6） 29.25±4.27a 35.83±4.96a 165.52±9.98a 164.51±13.01a家雞（domestic chicken，n＝15） 38.53±3.51b 43.00±4.97b 129.72±5.84b 129.37±7.82b大鼠（rat，n＝15） 66.27±4.64c 64.73±5.54c 109.65±4.54c 108.97±3.64c F 246.698 94.887 176.550 117.111 P 0.000 0.000 0.000 0.000

注：兩兩比較采用SNK－q檢驗或秩和檢驗，兩組間字母不同表示P＜0.05，字母相同表示P＞0.05。

（Pairwise comparisons using SNK－q test or rank sum test，the letters are different between the two groups，P＜0.05，the same letter，P＞0.05）

表2 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較（）Table 2 comparison of the number and gray value of nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

表2 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)數(shù)量及灰度值比較（）Table 2 comparison of the number and gray value of nNOS positive neuron in the dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animal（）

注：兩兩比較采用SNK－q檢驗或秩和檢驗，兩組間字母不同表示P＜0.05，字母相同表示P＞0.05。（Pairwise comparisons using SNK－q test or rank sum test，the letters are different between the two groups，P＜0.05，the same letter，P＞0.05）

類別（Kind） 細胞總數(shù)（Totally number）內(nèi)側部（medial part）外側部（lateral part）灰度值（Gray value）內(nèi)側部（medial part）外側部（lateral part）揚子鱷（alligator sinensis，n＝6） 22.00±2.85a 22.67±2.73a 152.83±8.20a 154.03±9.51a家雞（domestic chicken，n＝15） 43.23±5.16b 43.90±4.79b 127.47±9.20b 127.01±9.23b大鼠（rat，n＝15） 66.70±5.42c 77.70±6.76c 100.9±11.75c 98.18±5.60c F 191.321 261.781 60.964 117.325 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)外側部TH陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×400），圖中標尺示20μmFig.4the TH positive neuron in the lateral part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

圖5 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)內(nèi)側部nNOS陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×400），圖中標尺示20μmFig5the nNOS positive neuron in the medial part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

圖6 三種動物中腦導水管周圍背側灰質(zhì)外側部nNOS陽性神經(jīng)元（免疫組化染色 ×400），圖中標尺示20μmFig6the nNOS positive neuron in the lateral part of dorsal periaqueductal gray matter of midbrain in the three kinds of animals（IR ×400），scale bar＝20μm

討 論

從種系發(fā)生的角度看，揚子鱷、家雞及大鼠分別代表著從低等到較高等的進化趨勢；從胚胎學上來看，他們又代表著從卵生到胎生的演化；從活動規(guī)律來看，揚子鱷喜靜而大鼠喜動，家雞的活動特性處于二者之間。

實驗免疫組化結果顯示揚子鱷、家雞及大鼠中腦內(nèi)同一節(jié)段TH、nNOS免疫反應陽性神經(jīng)元的表達均呈由弱到強。TH是腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的合成酶，DA是腦內(nèi)最主要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)［5－6］。中腦DA能神經(jīng)元主要集中在SNc和VTA，并與紋狀體、大腦皮質(zhì)及邊緣葉形成DA神經(jīng)環(huán)路，對軀體運動、認知與思維能力、情緒反應的調(diào)節(jié)起重要作用［7］。有研究表明中腦VTA區(qū)TH的表達在腦的獎賞系統(tǒng)被激活時表達增加的水平受nNOS基因調(diào)節(jié)［8］。有研究表明nNOS免疫陽性神經(jīng)元可通過其所分泌的NO對其他神經(jīng)遞質(zhì)起調(diào)節(jié)作用，并參與內(nèi)臟活動、感覺和運動的傳導，以及睡眠和覺醒等腦的高級整合功能的調(diào)節(jié)［10］。本實驗結果結合上述資料提示三種動物中腦內(nèi)TH、nNOS的表達差異，可能與不同物種動物執(zhí)行相關功能的復雜程度有關，其中nNOS可能對物種進化過程的中腦TH的表達逐漸增加起調(diào)控作用，但確切機制有待進一步研究。

實驗同時對三種動物中腦TH、nNOS免疫反應陽性神經(jīng)元的大小、形態(tài)進行了觀察并比較，結果顯示三種動物腦干內(nèi)TH和nNOS陽性神經(jīng)元的大小、形態(tài)存在一定的差異。其中對大鼠和家雞觀察到的結果與已有的報道基本一致［11－14］，而揚子鱷中腦內(nèi)側部的大型TH、nNOS陽性神經(jīng)元所占比例較家雞和大鼠均高，這可能是揚子鱷腦中腦較發(fā)達及中腦視葉是其較高級中樞的形態(tài)學基礎，是否與其追逐食物、逃避敵害等有關還有待進一步研究。至于TH、nNOS免疫反應陽性神經(jīng)元在三種動物間呈現(xiàn)的形態(tài)上的異同，原因我們尚不清楚，但也為進一步研究揚子鱷腦的形態(tài)與功能積累了一定的形態(tài)學資料。

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