超聲預(yù)處理對(duì)玉米蛋白可酶解性的影響

金 建 馬海樂 曲文娟 周存山 羅 敏 何榮海 洪 晨 翁龍梅

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江 212013）

超聲預(yù)處理對(duì)玉米蛋白可酶解性的影響

金 建 馬海樂 曲文娟 周存山 羅 敏 何榮海 洪 晨 翁龍梅

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江 212013）

旨在采用超聲預(yù)處理改善玉米蛋白的酶解性，研究了超聲頻率模式（單頻、雙頻、定頻和掃頻）及頻率參數(shù)對(duì)玉米蛋白酶解水解度及溶解率的影響，采用高效尺寸排阻色譜法對(duì)酶解液的分子質(zhì)量分布進(jìn)行了表征。研究發(fā)現(xiàn)，（68±2）kHz／（28±2）kHz雙頻掃頻為最佳超聲頻率模式，優(yōu)化試驗(yàn)獲得超聲預(yù)處理的最佳工作參數(shù)為：超聲溫度30℃、料液比1∶20（g／mL）、超聲處理時(shí)間40 min、掃頻周期500 ms、超聲功率密度80W／L、脈沖超聲的工作時(shí)間10 s和間歇時(shí)間3 s。在最佳超聲頻率模式及工作參數(shù)預(yù)處理的條件下，水解度和蛋白溶解率分別為23.6%和75.2%，較對(duì)照組（未經(jīng)超聲處理）分別提高了39.4%和54.7%，且酶解液具有更窄的分子質(zhì)量分布范圍。這表明超聲預(yù)處理能促進(jìn)玉米蛋白向多肽轉(zhuǎn)化，尤其有利于分子質(zhì)量為200～1 000 u的玉米蛋白肽的形成。

超聲預(yù)處理 玉米蛋白 頻率模式 高效尺寸排阻色譜 分子質(zhì)量分布

玉米蛋白粉是濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)品，含有60%～71%的蛋白質(zhì)，其中醇溶蛋白占68%，谷蛋白占28%［1］。玉米蛋白的組成復(fù)雜、口感氣味不佳、水溶性差，且缺少賴氨酸、色氨酸等必需氨基酸，嚴(yán)重影響了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)主要將玉米蛋白用于飼料工業(yè)或自然排放，導(dǎo)致玉米蛋白質(zhì)資源得不到充分利用。本研究擬采用酶解法對(duì)玉米蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以提高其生物利用效價(jià)。

傳統(tǒng)酶解方法主要的不足包括反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、酶利用率低、底物轉(zhuǎn)化率低［2］等。超聲波技術(shù)因其獨(dú)特的聲化學(xué)效應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提?。?－6］、多肽制備時(shí)蛋白原料［1，7－11］及蛋白酶［1，12－13］的預(yù)處理。本研究擬在酶解前采取超聲對(duì)玉米蛋白進(jìn)行預(yù)處理，以期使得蛋白質(zhì)暴露出更多的酶切位點(diǎn)，增加底物與酶的接觸機(jī)會(huì)，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行，改善其可酶解性。通過試驗(yàn)研究，進(jìn)行超聲預(yù)處理參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米蛋白粉（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)58.3%）：邳州奮達(dá)淀粉有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（酶活23 400 U／mL）：諾維信（天津）生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞色素 C（12 500 u）、抑肽酶（6 500 u）、桿菌肽（1 450 u）：上海源葉生物科技有限公司；氧化型谷胱甘肽（612 u）、還原型谷胱甘肽（307 u）：Sigma－Aldrich公司。

1.2 主要儀器

脈沖掃頻超聲波設(shè)備：江蘇大學(xué)本課題組自主研制、無錫泛博生物工程有限公司制造；Ulti-Mate3000高效液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)DIONEX公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲頻率模式的確定

1.3.1.1 超聲頻率模式設(shè)定：超聲頻率可設(shè)定的模式包括單頻和雙頻、定頻和掃頻。單頻定頻及掃頻的頻率用fi±Δf表示，雙頻定頻及掃頻頻率及組合用 fi±Δf／fj±Δf表示，其中下標(biāo) i，j分別為 1、2、3、4和 5，對(duì)應(yīng)的 fi或 fj依次分別為 24、28、33、40和 68 kHz，Δf為 0、2 kHz。

1.3.1.2 玉米蛋白超聲波預(yù)處理：稱取玉米蛋白粉10 g，加入蒸餾水200mL，使得料液比達(dá)到1∶20 g／mL，在超聲頻率模式及參數(shù)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上研究預(yù)處理過程：溫度30℃，超聲功率密度60 W／L、脈沖超聲的工作時(shí)間10 s和間歇時(shí)間5 s、掃頻周期100 ms、時(shí)間60 min。對(duì)照組以磁力攪拌代替，溫度與時(shí)間同超聲處理組的保持一致。

1.3.1.3 玉米蛋白酶解修飾：超聲處理后的玉米蛋白懸浮液，蒸餾水稀釋至同一體積，50℃預(yù)熱10 min，利用Alcalase 2.4L進(jìn)行酶解。酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，酶底比［E］／［S］4 740 U／g、反應(yīng)溫度50℃、pH 9、酶解時(shí)間60min。酶解結(jié)束后，用0.1 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0并在沸水浴中滅酶10 min，冷卻到室溫后于5 000 r／min離心15min，收集清液備用。

每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)平行重復(fù)3次，測(cè)定溶解率和水解度，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.2 超聲預(yù)處理工作參數(shù)優(yōu)化

考察的因素為溫度、料液比、超聲處理時(shí)間、超聲掃頻周期、脈沖超聲工作時(shí)間、脈沖超聲間歇時(shí)間、單位體積超聲功率。每個(gè)因素的水平設(shè)計(jì)如下：溫度（℃）：20、30、40、50，料液比（g／mL）：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，超聲處理時(shí)間（min）：10、20、30、40、60，超聲掃頻周期（ms）：18、50、100、150、200、300、500、700，脈沖工作時(shí)間（s）：10、12、15、18，脈沖間歇時(shí)間（s）：3、4、5、6，超聲功率密度（W／L）：48、60、80、100、120。

1.3.3 測(cè)定方法

1.3.3.1 水解度（DH）（pH－stat法測(cè)定［14］）

式中：htot為摩爾肽鍵數(shù)，玉米蛋白為9.2 mmol／kg；α為簇氨基在蛋白底物中平均解離度，Alcalase在pH 9.0、50℃的試驗(yàn)條件下，1／α為1.01；Mp為底物蛋白質(zhì)量／g；Nb為堿液物質(zhì)的量濃度／mol／L；B為消耗的堿液體積／mL。

1.3.3.2 溶解率（DR）

式中：C為可溶性氮含量，采用福林－酚法測(cè)定［15］／mg／mL；V為酶解液體積／mL；N0為底物蛋白含量／g。

1.3.3.3 高效液相排阻色譜工作條件

色譜柱：TSKgel G2000SW XL（規(guī)格7.8 mm×300mm ×5μm），流動(dòng)相：V三氟乙酸∶V乙腈∶V水＝0.1∶45∶55，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，進(jìn)樣量：10μL，流速：0.5 mL／min，柱溫：30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲頻率模式及頻率參數(shù)的影響

超聲頻率模式及頻率參數(shù)對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，經(jīng)超聲預(yù)處理后玉米蛋白的水解度及蛋白溶解率明顯高于對(duì)照組；整體講，雙板優(yōu)于單板，掃頻優(yōu)于定頻。超聲波的頻率增加，膨脹和壓縮循環(huán)的時(shí)間縮短，若膨脹循環(huán)時(shí)間太短，微小泡核不能長(zhǎng)到足夠大引起液體介質(zhì)的破裂、形成空化氣泡，空化作用強(qiáng)度下降，超聲化學(xué)效應(yīng)相應(yīng)下降；因此，當(dāng)超聲波強(qiáng)度一定時(shí)，頻率越高，空化作用越?。?6］。從超聲處理后玉米蛋白的水解度及溶解率來看，最優(yōu)超聲頻率模式為（68±2）kHz／（28±2）kHz，后續(xù)試驗(yàn)以此模式進(jìn)行。

2.2 超聲預(yù)處理工作參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 超聲預(yù)處理溫度的確定

在其他工作參數(shù)同1.3.1的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，酶解溫度對(duì)蛋白水解度及溶解率的影響試驗(yàn)

圖1 超聲頻率模式對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

結(jié)果如圖2所示，同時(shí)進(jìn)行了對(duì)照試驗(yàn)。

圖2 溫度對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

由圖2可知，超聲預(yù)處理后，蛋白的水解度與溶解率都明顯高于對(duì)照組。隨超聲處理溫度的升高，水解度變化不大，而酶解液溶解率呈現(xiàn)明顯的先升后降的趨勢(shì)。溫度升高，蛋白顆粒溶脹，在空化泡破裂的瞬間產(chǎn)生強(qiáng)大的沖擊波，能夠擊碎淀粉之間的交聯(lián)作用，有利于蛋白的溶出，同時(shí)超聲波能暴露出蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)，增加底物與酶的接觸機(jī)會(huì)；另一方面，溫度升高的同時(shí)，液體媒介的蒸汽壓增加，從而崩潰時(shí)伴隨產(chǎn)生的最大壓力值Pmax降低［16］，空化作用減弱。經(jīng)方差分析，在溫度30℃與40℃的條件下，蛋白的水解度及溶解率沒有顯著性差異（P＞0.05），故選取溫度為30℃。

2.2.2 最佳料液比的確定

在料液溫度為30℃、其他工作參數(shù)同1.3.1的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，料液比對(duì)酶解效果的影響如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

由圖3可知，在一定的料液比范圍內(nèi)，蛋白水解度與溶解率均隨料液比增大而增大，隨后下降。料液比越大、單位體積的顆粒分布越密集，在超聲空化效應(yīng)作用下，顆粒之間的碰撞次數(shù)增多，反之，料液比越小，顆粒之間的碰撞機(jī)會(huì)減??；但料液比過大，在超聲波與熱的共同作用下，體系的黏度增加，空化效應(yīng)會(huì)減弱。因此，選取料液比1∶20為宜。

2.2.3 超聲處理時(shí)間的確定

在料液溫度為30℃、料液比為1∶20、其他工作參數(shù)同1.3.1的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲處理時(shí)間對(duì)蛋白水解度及溶解率的影響如圖4所示。

圖4 超聲處理時(shí)間對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

從圖4可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的增加，蛋白的水解度變化不明顯，但蛋白溶解率呈上升趨勢(shì)，40 min后趨于平緩。超聲處理時(shí)間越長(zhǎng)，溶解出來的蛋白越多，但是可酶解的底物蛋白含量基本一致；另一方面，釋放出來的蛋白顆?？赡苤匦戮奂?，在酶的作用下得以舒展，但還未達(dá)到酶解的程度，因此水解度不變，溶解率升高。Jayani等［17］利用20 kHz、31 W的超聲處理乳清蛋白60 mL，觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲處理時(shí)間＞5 min時(shí)，熱焓增加，表明了蛋白聚集的可能性。從而，超聲處理時(shí)間選取40 min為宜。

2.2.4 超聲掃頻周期的確定

在料液溫度為30℃、料液比為1∶20、超聲處理時(shí)間為40 min、其他工作參數(shù)同1.3.1的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲掃頻周期對(duì)蛋白水解度及溶解率的影響如圖5所示。

圖5 掃頻周期對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

由圖5可知，超聲掃頻周期對(duì)蛋白水解度和溶解率的影響都比較明顯，兩者的變化趨勢(shì)大致一致。在0～100 ms和200～500 ms范圍內(nèi)，兩者都呈上升趨勢(shì)；100～200 ms之間，兩者均有不同程度的下降。毛舒云等［18］利用掃頻超聲處理玉米醇溶蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)掃描周期為100 ms時(shí)，水解度和ACE抑制率發(fā)生突變，認(rèn)為100 ms是產(chǎn)生顯著共振的開啟點(diǎn)。在相同的時(shí)間內(nèi)，掃頻周期的長(zhǎng)短，直接影響到波形、波長(zhǎng)大小及波數(shù)；當(dāng)兩列波疊加時(shí)，產(chǎn)生的效果也截然不同。從圖5來看，選擇掃描周期500 ms比較合適。

2.2.5 超聲脈沖工作時(shí)間及脈沖間歇時(shí)間的確定

在料液溫度為30℃、料液比為1∶20、超聲處理時(shí)間為40 min、掃描周期500 ms、其他工作參數(shù)同1.3.1的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲脈沖工作時(shí)間及脈沖間歇時(shí)間對(duì)蛋白水解度及溶解率的影響如圖6a～圖6b所示。

圖6 脈沖工作時(shí)間及脈沖間歇時(shí)間對(duì)玉米蛋白水解度及溶解率的影響

超聲波間歇性的發(fā)出，可以顯著增加對(duì)處理對(duì)象的作用效果［19］。由圖6a～圖6b可知，隨脈沖工作時(shí)間和間歇時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白水解度及溶解率均有不同程度的下降，脈沖超聲時(shí)間長(zhǎng)，在相等的超聲處理時(shí)間下，產(chǎn)生的空化泡數(shù)量相對(duì)較多，一些空化泡在來不及膨脹的狀況下就已經(jīng)破裂，對(duì)媒介產(chǎn)生的沖擊力較??；間歇時(shí)間越長(zhǎng)，物料受到的超聲作用有較長(zhǎng)的時(shí)間恢復(fù)到原始狀態(tài)。從圖6來看，選擇脈沖工作時(shí)間10 s、間歇時(shí)間3 s為宜。

2.2.6 超聲功率的確定

在料液溫度為30℃、料液比為1∶20、超聲處理時(shí)間為40 min、掃描周期500 ms、脈沖超聲工作時(shí)間10 s、間歇時(shí)間3 s的條件下進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲功率對(duì)蛋白水解度及溶解率的影響如圖7所示。

圖7 超聲功率對(duì)玉米蛋白水解度及蛋白溶解率的影響

從圖7可以看出，單位體積超聲功率對(duì)蛋白水解度的影響不大，對(duì)其溶解性的影響相當(dāng)明顯。功率過低，包裹在蛋白外面的淀粉顆粒不能被擊碎，從而不利于蛋白的釋放；但功率過大，體系溫度會(huì)上升，空化作用減弱；另一方面，游離出的蛋白質(zhì)顆粒會(huì)重新形成聚集體［20］，其溶解性降低，同時(shí)，蛋白的酶切位點(diǎn)可能被包埋起來，降低了與酶的接觸機(jī)會(huì)。因此，選取超聲功率為80 W／L。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在以上優(yōu)化得出的最佳超聲頻率模式及工作參數(shù)的條件下對(duì)玉米蛋白進(jìn)行預(yù)處理，同時(shí)作對(duì)照試驗(yàn)，酶解效果如圖8所示。

圖8 超聲輔助酶解和常規(guī)酶解（對(duì)照）的酶解效果比較

從圖8可以看出：玉米蛋白超聲預(yù)處理后，其水解度為23.6%，與傳統(tǒng)酶解的水解度17.0%相比，提高了39.4%；蛋白溶解率由傳統(tǒng)酶解的48.6%提高至75.2%。經(jīng)方差分析，超聲預(yù)處理對(duì)玉米蛋白的水解度及溶解率均有顯著性的提高（P＜0.05）。

2.4 分子質(zhì)量分布范圍的確定

以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到校準(zhǔn)曲線，如圖9所示。分別取超聲輔助酶解和常規(guī)酶解的酶解液1 mL，稀釋10倍，過0.22μm尼龍膜，上樣，其洗脫曲線如圖10所示，分子質(zhì)量分布如表1所示。

圖9 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量校準(zhǔn)曲線

圖10 超聲輔助酶解和常規(guī)酶解的酶解液洗脫曲線

表1 超聲輔助酶解和常規(guī)酶解的酶解液分子質(zhì)量分布

從圖10和表1可以看出，無論是超聲輔助酶解，還是常規(guī)酶解，玉米蛋白酶解液的分子質(zhì)量分布均是連續(xù)的，范圍主要集中在200～1 000 u。超聲輔助酶解的酶解液具有更窄的分子質(zhì)量分布，Zhu等［10］和Yang等［21］結(jié)果表明超聲處理在某種程度上能抑制小肽的形成。其原因可能在于：超聲預(yù)處理能暴露出蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸［8］，本研究所選的蛋白酶為堿性蛋白酶，其作用位點(diǎn)要求在水解點(diǎn)羧基側(cè)有芳香族或疏水性氨基酸［22］，但它優(yōu)先水解不帶電荷疏水性的較大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)或肽鍵［23］；而常規(guī)酶解方法，酶作用的位點(diǎn)及有效酶解蛋白量相對(duì)較少，使得大分子片段及游離氨基酸含量相對(duì)較高。

3 結(jié)論

3.1 超聲預(yù)處理能提高玉米蛋白的水解度，增加其溶解率，得出最佳超聲工作頻率模式：雙頻掃頻（68±2）kHz／（28±2）kHz。

3.2 基于最佳頻率模式，得出超聲預(yù)處理的最佳工作參數(shù)：溫度30℃，料液比1∶20 g／mL，超聲處理時(shí)間40min，掃描周期500ms，脈沖超聲時(shí)間10 s，脈沖間歇時(shí)間3 s，單位體積超聲功率80 W／L。

3.3 最佳超聲工作條件下處理的玉米蛋白，在Alcalase 2.4L FG、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%、［E］／［S］4740 U／g、溫度50℃、pH 9.0、時(shí)間60 min的酶解條件下，其水解度為23.6%，比常規(guī)酶解提高了39.4%；蛋白溶解率為75.2%，比對(duì)照組提高了54.7%。

3.4 高效尺寸排阻色譜結(jié)果顯示：與常規(guī)酶解的酶解液相比，玉米蛋白經(jīng)超聲預(yù)處理后，酶解液具有更窄的分子質(zhì)量分布范圍，該方法有利分子質(zhì)量為200～1 000 u玉米肽的形成。

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Effects of Ultrasound Pretreatment on the Enzymatic Hydrolysis of Corn Gluten Meal

Jin Jian Ma Haile Qu Wenjuan Zhou Cunshan Luo Min He Ronghai Hong Chen Weng Longmei
（School of Food and Biological Engineering Jiangsu Provincial Key Lab for Physical Processing of Agri－products Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

To study the effects of ultrasound pretreatmenton the degree of hydrolysis（DH）and dissolution ratio（DR）of corn gluten meal（CGM）.The ultrasonic frequency mode（single frequency，dual－frequency，fixed frequency and sweep frequency），and the operating parameters of ultrasound on the enzymatic hydrolysis of CGM were optimized.The High perfermance size exclusion chromatography（HPSEC）was utilized to characterize themolecular weight（MW）distribution of hydrolysate.The results showed that the optimal condition of ultrasonic frequencymode was（68±2）kHz／（28±2）kHz；the optimum operating pretreatment parameters conditionswere temperature of ultrasonic condition at30℃，ultrasonic treatment time of40min，pulsed on－time 10 s on and off－time3 s off，cycle time of the sweep frequency 500 ms，and ultrasonic power density 80 W／L.The pretreated CGM was subsequently hydrolyzed byAlcalase2.4L with an enzyme／substance ratio of 4 740 U／g，temperature at 50℃，pH 9.0 and 60 min.Under the optimum condition of ultrasonic frequencymode and operating parameters，the DH and DR of CGM were as23.6%and 75.2%，which were 39.4%and 54.7%higher than thatof the control respectively.The results indicated that the ultrasonic pretreatment could have a facilitative effect on the enzymatic hydrolysis of CGM，which will promote the conversion of protein to peptides，especially the peptideswith a MW of 200～1 000 u.

ultrasound pretreatment，corn glutenmeal，frequencymode，high performance size exclusion chromatography，molecular weight distribution

TS201.1

A

1003－0174（2015）11－0058－07

863計(jì)劃 （2013AA102203），國(guó)家自然科學(xué)基金（3130 1423），江蘇省產(chǎn)學(xué)研前瞻性研究（BY2013065－01），江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（CXZZ13＿0695）

2014－04－11

金建，男，1986年出生，博士，生物大分子的功能化

馬海樂，男，1963年出生，教授，食品物理學(xué)加工方法