球花石楠黑斑病菌生物學(xué)特性

韓長(zhǎng)志，李瑞強(qiáng)

(西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650224)

球花石楠Photinia glomerata Rehd．et Wils．作為云南省重要的鄉(xiāng)土樹(shù)種，已經(jīng)廣泛用于城市綠化和景觀設(shè)計(jì)，但是近年來(lái)球花石楠黑斑病在昆明地區(qū)發(fā)病呈逐漸嚴(yán)重趨勢(shì)，成為影響城市綠化的重要因素之一。作者通過(guò)前期對(duì)球花石楠黑斑病的病害調(diào)查以及病原菌分離、鑒定，明確該病害是由鏈格孢屬Alternaria Nees真菌引起［1］。本研究從不同培養(yǎng)基、溫度、pH值、光照、通氣條件以及不同碳源、氮源等方面，對(duì)球花石楠黑斑病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期解釋鏈格孢屬真菌寄主范圍較廣、分布較廣的原因，也為進(jìn)一步研究該病菌致病原因和防治提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種球花石楠黑斑病菌分離于西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的球花石楠葉片，將獲得的純培養(yǎng)菌株保存在試管斜面于4℃冰箱中。菌種保藏于西南林業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)教研室，菌種編號(hào)QHSN-1。

1.2 病原菌生物學(xué)特性研究

選擇常規(guī)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)病菌。即，用打孔器(直徑7 mm)將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(28℃恒溫培養(yǎng)箱、黑暗條件)的病原菌菌落打成菌絲塊接種PDA培養(yǎng)基上(不同的培養(yǎng)基、碳源和氮源測(cè)試除外)，28℃恒溫培養(yǎng)(不同溫度測(cè)試除外)，觀察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，統(tǒng)計(jì)分析病原菌生長(zhǎng)差異。

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 共5種培養(yǎng)基，每種處理5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)5 d。

①馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;②馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA):馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;③燕麥培養(yǎng)基(OA):燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL;④清水洋菜培養(yǎng)基(WA):瓊脂粉20 g、水1000 mL;⑤玉米粉培養(yǎng)基(CMM):玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將病原菌分別置于5，11，22，28，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.3 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在無(wú)菌條件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)滅菌的PDA培養(yǎng)基pH值，設(shè)pH值為3，4，5，6，7，8，9，10，11等9個(gè)梯度，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.4 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同光照條件采用光照4 d、黑暗4 d和光照黑暗各2 d(光暗交替)3種處理，黑暗條件用有蓋黑色紙筒罩住。每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)4 d。

1.2.5 不同通氣條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用培養(yǎng)皿Parafilm膠帶封口和不封口2種方法進(jìn)行。每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.6 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加碳源為對(duì)照，用含有相當(dāng)量碳的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多種碳源代替查氏培養(yǎng)基中蔗糖，做成不同碳源的固體培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.2.7 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加氮源為對(duì)照，用含有相當(dāng)?shù)南跛徜@、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多種氮源代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，做成不同氮源的固體培養(yǎng)基，每種處理重復(fù)5次，培養(yǎng)5 d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析用Excel 2007對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理和作圖。所有圖形中的正負(fù)偏差均表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響球花石楠黑斑病菌除在WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不好外，在其他培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)較好，尤以在PSA、PDA上生長(zhǎng)最快，且菌絲最為密集(圖1)。病原菌在不同培養(yǎng)基上所形成的菌落顏色不同，PSA、PDA培養(yǎng)基上的菌落顏色為灰色至黑暗色，而CMM、OA培養(yǎng)基上的菌落則灰色至紅褐色(表1)。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

表1 不同培養(yǎng)基上的病原菌菌落形態(tài)特征

2.2 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響從圖2可以看到，在設(shè)置的11，22，28℃條件下，菌絲均能正常生長(zhǎng)，尤以28℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快;而在5，37℃條件下，病原菌菌絲不能正常生長(zhǎng)，將其轉(zhuǎn)移至28℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)后，菌絲又能恢復(fù)生長(zhǎng)，說(shuō)明5℃的低溫和37℃高溫并未將該病原菌殺死，只是抑制了生長(zhǎng)。因此，球花石楠黑斑病病菌生長(zhǎng)的最適溫度為28℃。后續(xù)研究選擇該溫度對(duì)病菌進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。

2.3 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響在pH 4～11時(shí)病原菌都能生長(zhǎng)，尤以pH 6～9時(shí)病原菌生長(zhǎng)較快，其中，pH 8時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最快，其次為6，7;病原菌在極酸條件(pH為3，4，5)下不能生長(zhǎng)，或受到抑制(圖3)。可見(jiàn)，病原菌菌絲適宜在中性至偏堿性環(huán)境生長(zhǎng)，極酸環(huán)境不利生長(zhǎng)。

圖2 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

圖3 不同p H對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

2.4 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3種光照條件下菌落生長(zhǎng)速率僅有較小的差異(圖4)，培養(yǎng)性狀略有差異，在4 d全部光照條件下病原菌菌絲最密集，菌落顏色最深。

圖4 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

2.5 不同通氣條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響利用parafilm封口膜封口的條件下，菌絲生長(zhǎng)情況好于不封口的(10．8 mm/d＞10．5 mm/d)，生長(zhǎng)速度更快，同時(shí)，用parafilm封口可以較好地防止病原菌受到污染，有利于后續(xù)試驗(yàn)的開(kāi)展。

2.6 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌在所供試的8種含有不同碳源的培養(yǎng)基上都能快速生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率差異較小;在不加碳源為對(duì)照的培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)較為稀疏，且顏色很淺(圖5)。

圖5 不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的影響

上述結(jié)果表明，病原菌的正常生長(zhǎng)與碳源關(guān)系非常密切，其可利用的碳源種類(lèi)較為豐富，尤以麥芽糖最佳。

2.7 不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響病原菌在以蛋白胨、甘氨酸和硝酸鈉作為氮源的條件下生長(zhǎng)速率較快，且菌絲形態(tài)較為密集、菌落較厚，而在不加氮源為對(duì)照的培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)極為稀疏，且顏色極淺;另外，以磷酸二氫銨、硫酸銨作為氮源時(shí)，病原菌生長(zhǎng)受到抑制(圖6)。

圖6 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響

3 結(jié)論與討論

球花石楠的樹(shù)冠圓整、葉片光綠，以及在不同季節(jié)所具有的觀賞價(jià)值使其廣泛應(yīng)用于城市園林綠化中。目前，對(duì)于球花石楠的研究涉及組織離體培養(yǎng)［2］、種子育苗［3］以及脅迫條件下體內(nèi)生理特性［4］等方面，對(duì)其病害的報(bào)道有黑斑?。?］、銹?。?］等。

本研究以球花石楠黑斑病菌為研究對(duì)象，通過(guò)不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照、通氣狀況、碳源、氮源等條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響研究表明，該病原菌生長(zhǎng)最適條件為PDA，28℃，封閉，pH 8，碳源為麥芽糖，氮源為蛋白胨，其酸堿度的適應(yīng)范圍較廣。同時(shí)，為了更好地研究光照條件對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響，本研究對(duì)光照條件的設(shè)置并未使用常規(guī)的8 h光照/16 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗以及16 h光照/8 h黑暗，而是將光照、黑暗條件進(jìn)行極端化處理，設(shè)置4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3種處理，明確該病菌可以較好地利用不同的光照條件。上述結(jié)果對(duì)于解釋該菌侵染寄主范圍較廣、分布較廣的原因，也為進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)病原菌的侵染循環(huán)、發(fā)生規(guī)律以及防治方法等方面的研究奠定重要的理論基礎(chǔ)。

此外，本研究明確球花石楠黑斑病菌的正常生長(zhǎng)與氮源關(guān)系非常密切，其可利用的氮源種類(lèi)較為豐富，尤以蛋白胨最佳。該病原菌不能利用某些氮源，推測(cè)其體內(nèi)可能缺少相關(guān)酶類(lèi)，這為進(jìn)一步采用這些氮源作為營(yíng)養(yǎng)劑來(lái)防治病原菌提供了理論依據(jù)。

［1］ 韓長(zhǎng)志，李瑞強(qiáng)．球花石楠黑斑病病害調(diào)查及病原鑒定初報(bào)［J］．中國(guó)森林病蟲(chóng)，2014(5):8-9．

［2］ 林萍，普曉蘭．球花石楠離體培養(yǎng)及快速繁殖研究［J］．植物研究，2003(3):280-284．

［3］ 白平．球花石楠種子育苗技術(shù)［J］．福建林業(yè)科技，2011(1):86-88．

［4］ 黃曉霞，黃大韌，楊自云，等．土壤干旱與鹽脅迫對(duì)球花石楠幼苗生理特性的影響［J］．北方園藝，2010(21):87-89．

［5］ 蔡燦，伍建榕．球花石楠銹病病原物的初步研究［J］．北方園藝，2008(1):208-210．