豬圓環(huán)病毒病原生物學(xué)研究進(jìn)展

時 代，潘 玲，楊克禮 ，米顯高，米國武(1．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢40064;．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥001;．湖北省鶴峰縣興華畜牧業(yè)有限公司，湖北鶴峰445800)

1974年，科學(xué)家Tisher等觀察幾株傳代PK-15細(xì)胞時在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)了一種類似細(xì)小病毒的圓形顆粒狀粒子，這些小粒子并不導(dǎo)致細(xì)胞病變，因此被研究人員認(rèn)為是一種普通的污染物［1］。直到1982年，Tischer等用超速離心機離心后提取了該病毒粒子，通過電鏡觀察病毒形態(tài)，終于發(fā)現(xiàn)這并不是普通的細(xì)胞污染物，而是一類沒有囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，并將其命名為豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)。此后，在德國、加拿大、英國、北愛爾蘭、新西蘭、美國等國家的豬群中PCV抗體血清均檢測呈陽性，但人工感染該PCV病毒后并不會造成豬只臨床癥狀和病理上的變化［2－4］。1991年，Clark等在加拿大某些豬場中首次發(fā)現(xiàn)1種被稱為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的傳染病，被感染的仔豬生長受阻、呼吸急迫、體型也出現(xiàn)消瘦、黃疸、貧血，剖檢發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、肝臟質(zhì)地變硬、間質(zhì)性肺炎。該病在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，美國、法國、日本、北愛爾蘭、韓國、德國、西班牙、意大利等國家相繼發(fā)現(xiàn)了PMWS的感染［5－8］。我國有學(xué)者于2000年利用ELISA方法檢測到了該病的存在［9］?；诖耍P者對PCV病原生物學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為今后開展豬圓環(huán)病毒的診斷及防控技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1 豬圓環(huán)病毒的病毒學(xué)分類

國際病毒分類委員會(ICTV)在第六次學(xué)術(shù)報告中新命名了圓環(huán)病毒科，其中包括圓環(huán)病毒屬(Circovirus)、矮縮病毒屬(Nanovirus)、環(huán)病毒屬(Gyrovirus)以及最新定名的一個新屬Anellovirus。該科病毒都是由單股圓環(huán)狀的DNA鏈組成，無囊膜。圓環(huán)病毒科除了常見的豬圓環(huán)病毒外，還有鴨圓環(huán)病毒(Cuck circovirus，DuCV)、鵝圓環(huán)病毒(Goose circovirus，GCV)、鴿圓環(huán)病毒(Pigeoncircovirus，PiCV)、金絲雀圓環(huán)病毒(Canary circovirus，CaCV)、鸚鵡喙羽病病毒(Beak and feather disease virus，BFDV)、雞貧血病病毒(Chicken anaemia virus，CAV)等動物病毒。在植物中還發(fā)現(xiàn)了椰樹葉腐爛病毒(Coconutfoliar decay virus，CFDV)、地三葉草侏儒病毒(Subterranean clover stunt virus，SCSV)、香蕉簇頂病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)等植物病毒［10－13］。PCV 和該屬其他不同成員都有2個最大的主要開放閱讀框，分別負(fù)責(zé)編碼病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白和病毒的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白;屬內(nèi)成員之間復(fù)制相關(guān)的蛋白有很高的氨基酸同源性，約為40% ～60%;這2種蛋白都具有環(huán)柄序列基元，這與病毒復(fù)制的啟動有一定的關(guān)系［14］。

2 豬圓環(huán)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

PCV病毒粒子無囊膜、二十面對稱球形，直徑14～25 nm，平均直徑17 nm［15］，單鏈閉合結(jié)構(gòu)，是目前為止動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最小的病毒之一。PCV病毒粒子是由一條多肽分子鏈的衣殼蛋白和核酸組成，其中衣殼蛋白分子量大約為3．6×104Da;核酸是一個環(huán)狀的DNA單鏈，長度為1 767或1 768 bp［16］。PCV 在 CsCl中浮密度為 1．33 ～1．37 g/cm3，沉降系數(shù)約52S。PCV對不良環(huán)境有很強的抵抗力，在70℃高溫環(huán)境中可以生存 15 min［17］，56 ℃ 不能使其失去活性［18］。它可以在pH 3的酸性環(huán)境中長時間生存，而不被滅活。一般的消毒劑(如碘酒、酒精等)對其無效，但對氫氧化鈉、次氯酸鈉、季銨鹽混合物、酚混合物的耐受力較弱，相對比較敏感［19］，PCV 不存在血凝作用［20］。

3 PCV的體外培養(yǎng)

PCV可以在PK-15細(xì)胞和Vero細(xì)胞中生長增殖，在動物的外周血液、肺洗液的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)中也可以增殖［21］，其最佳的體外培養(yǎng)場所是PK－15細(xì)胞，PCV病毒的復(fù)制依靠S期的細(xì)胞表達(dá)蛋白。Tischer等［22］研究發(fā)現(xiàn)，用DMEM處理細(xì)胞培養(yǎng)物后可以促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并且在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體。感染PCV病毒的PK－15培養(yǎng)細(xì)胞主要是以胞漿內(nèi)包涵體的形式存在的，少數(shù)感染細(xì)胞內(nèi)還會含有核內(nèi)包涵體。

4 PCV的分子生物學(xué)特征

PCV為環(huán)狀的DNA分子，只有1條單鏈，PCV1的全基因組長1 759 bp，其中能夠編碼蛋白且蛋白大于5 kD的開放閱讀框有7個［23］。PCV2的全長為1 767 bp或1 768 bp，通過軟件分析其全長序列，判斷其中可能含有11個開放閱讀框，也有人認(rèn)為其實只有6個，這些開放閱讀框之間大小有很大的差異［24－25］。

同種基因型的PCV基因組有較高的同源性，達(dá)到95%，而不同基因型的PCV基因組的同源性只有76%。ORF1位于病毒正鏈，編碼病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，它的核酸和氨基酸的同源性分別為83%和86%，差異較小。ORF2位于病毒負(fù)鏈，編碼病毒的衣殼蛋白Cap蛋白，ORF2的差異較大，核酸和氨基酸同源性分別為67%和65%［26－27］。

在Rep蛋白和Cap蛋白之間有1段111 bp長的DNA(728～838 nt)片段，病毒復(fù)制的起始點就在這里，若發(fā)生突變將會對病毒的復(fù)制產(chǎn)生嚴(yán)重的影響［23］。研究發(fā)現(xiàn)，在PCV 2個主要蛋白基因之間有一條回文序列，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-loop structure)，它的頂部有一保守的九聚體結(jié)構(gòu)(5’-TAGTATTAC-3’)，而CGGCAGCGG/TCAG在這段序列中重復(fù)出現(xiàn)了2次，據(jù)此可以判斷這段序列是啟動復(fù)制蛋白的結(jié)合位點［28］。

5 PCV主要蛋白的研究進(jìn)展

5．1 Rep蛋白的研究進(jìn)展 Rep蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，由 ORF1編碼［29］。PCV1 的 Rep蛋白為 35．6 kD，由 312 個AA組成。PCV2的 Rep蛋白為35．8 kD，由314個 AA組成［24］。ORF1是一個保守的開放閱讀框，這就導(dǎo)致不同PCV株的Rep蛋白的抗原性非常接近，氨基酸同源率達(dá)86%。正是這個原因?qū)е铝?種血清型的PCV之間存在著交叉感染。在Rep基因中存在3個與基因復(fù)制相關(guān)的保守基序Ⅰ(FTLNN)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK)及結(jié)合 dNTPs的 P 環(huán)(P-loop)結(jié)構(gòu)(序列 G-GKS)［30］。Rep蛋白的功能靠該結(jié)構(gòu)維持，若發(fā)生突變或者缺失，都會給病毒的復(fù)制造成影響。

Rep蛋白具有很高的保守性，PCV Rep蛋白與植物的Nanovirus和Geminivirus的Rep蛋白同源性很高。根據(jù)生物進(jìn)化規(guī)律及物種間親緣關(guān)系分析表明，圓環(huán)病毒的Rep蛋白可能是Nanovirus與嵌杯樣病毒之類的小RNA病毒的RNA結(jié)合蛋白或者原核生物的解旋酶發(fā)生了重組的結(jié)果［31－33］。據(jù)此推斷，PCV很有可能是聯(lián)系動植物病毒之間的一座橋梁。

5．2 Cap蛋白的研究進(jìn)展 ORF2開放閱讀框編碼病毒的Cap蛋白，它是由234個氨基酸組成，分子量大小約為28 kD，是病毒入侵細(xì)胞之后在細(xì)胞內(nèi)各種酶的作用下形成的病毒的核衣殼，是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白［24］。PCV感染細(xì)胞后6～12 h可以檢測到細(xì)胞中Cap蛋白的存在，12 h后可以在細(xì)胞核中定位出來［34］。與ORF1有很高的保守性不同，ORF2的變異則較大，不同基因型的PCV ORF2同源性約70%。有研究人員利用軟件預(yù)測PCV全序列中的抗原位點，發(fā)現(xiàn)PCV中存在的抗原位點共有5個，只有一個在ORF1上，其余4個全部位于ORF2中［35］。分析PCV高免血清同Cap蛋白的結(jié)合位點發(fā)現(xiàn)，在Cap蛋白的第169～183位氨基酸片段中，PCV1與PCV2的Cap蛋白都能與2種基因型的PCV高免血清發(fā)生特異性結(jié)合，有交叉反應(yīng)性。在PCV2 Cap蛋白上有3個是針對PCV2血清型的抗原位點，分別位于氨基酸序列的65～87位、112～139位、193～207位，它們只與PCV2高免血清特異性反應(yīng)，和其他血清型的高免血清沒有作用。這表明在Cap蛋白的這3個區(qū)域里面有PCV2型特異性的抗原位點，其中112～139位是PCV2感染的特征，可以依此為標(biāo)志建立血清學(xué)方法檢測PCV2的感染［36］。有學(xué)者在研究PCV單克隆抗體的過程中發(fā)現(xiàn)，在PCV的Cap蛋白中存在著一個中和抗原表位［37］。將PCV2 ORF2基因和它的連續(xù)缺失產(chǎn)物，與PCV1 ORF2相交換，在PCV1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了帶有PCV2 ORF2基因片段的PCV1/PCV2重組嵌合病毒。再通過PCV2的特異性單克隆抗體來研究不同類型嵌合病毒的免疫反應(yīng)性的差別，定位PCV2的Cap蛋白表位，結(jié)果表明在PCV2的Cap蛋白的第47～233位的氨基酸序列中，至少存在5個優(yōu)勢表位。在230～233位區(qū)域內(nèi)，PCV2陽性血清和嵌合病毒結(jié)合于Cap蛋白氨基酸區(qū)域內(nèi)，分別定位在63～85以及165～185位。在Cap蛋白N端部分含有豐富堿性氨基酸，在裝配階段和DNA結(jié)合，這部分氨基酸可能與病毒衣殼的內(nèi)表面形成有一定的關(guān)系［38］。

2001年，Liu等［39］用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出ORF2基因，并且證明了表達(dá)出來的蛋白有很強的免疫原性。也有學(xué)者利用真核表達(dá)出了PCV ORF2蛋白，通過對表達(dá)產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，其中至少存在著2個糖基化位點;Western-blot分析表明，表達(dá)產(chǎn)物的片段大小和PCV病毒的核衣殼大小十分相近，將該產(chǎn)物純化染色后在電子顯微鏡下觀察，其形態(tài)與PCV病毒粒子非常相似，直徑為17 nm，有些顆粒由于中心濃染而類似于空衣殼，結(jié)果證實了表達(dá)出的蛋白可以在體外環(huán)境中組裝成病毒樣粒子。在細(xì)胞中表達(dá)的Cap蛋白可以被定位于核周，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中對定位信號起到?jīng)Q定作用的是12～18和34～41位區(qū)域內(nèi)的堿性氨基酸［40］。用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)基因定位域缺失的ORF2 rCap蛋白，結(jié)果表明該蛋白的單克隆抗體同樣保留Cap蛋白的反應(yīng)原性，并且同時保持了對PCV2的中和活性［41］。

PCV2毒力的大小與ORF2基因有很大的關(guān)系，不同地區(qū)分離到的PCV2毒株之所以毒力不同，很可能是由于ORF2基因發(fā)生了變異造成的，并且ORF2基因還可能影響病毒在細(xì)胞中的增殖滴度。Fenaux等將PCV1和PCV2的ORF2基因互相調(diào)換，構(gòu)建了2株嵌合型病毒，分別是PCV1為基礎(chǔ)導(dǎo)入PCV2 ORF2的PCV1-2和以PCV2為基礎(chǔ)導(dǎo)入PCV1 ORF2的PCV2-1。在導(dǎo)入PCV1 ORF2置換后，PCV2的毒力大大降低［42］。將PCV2感染PK15細(xì)胞，經(jīng)過120代連續(xù)傳代后，可以發(fā)現(xiàn)病毒的增殖滴度第1代為102．83TCID50/ml，第 120代 病毒的 增殖滴度 可升高 到 103．75TCID50/ml，經(jīng)過連續(xù)傳代的病毒的毒力也大大減弱。收集各個代次的病毒，分別將全基因組測序，通過對比發(fā)現(xiàn)在120代病毒的ORF2中出現(xiàn)了2個位點的突變，其中1個為110位P變?yōu)锳，另1個是第191位由R變成S。這說明這2個位點的突變可能造成了病毒毒力的改變。

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