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    己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá)臨床意義

    2015-12-17 06:30:14
    交通醫(yī)學(xué) 2015年1期
    關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄直腸癌

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    己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá)臨床意義

    龔海*,石欣,劉雙海

    (東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院肛腸外科,江蘇214400)

    [摘要]目的:檢測己糖激酶-Ⅱ基因在直腸癌組織中表達(dá),探討其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法:通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡方法、免疫組織化學(xué)方法了解己糖激酶-Ⅱ在直腸癌100例組織中表達(dá),探討與腫瘤病理因素關(guān)系。結(jié)果:RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示直腸癌組織陽性表達(dá)己糖激酶-Ⅱ在RNA水平顯著高于正常組織陽性表達(dá)。直腸癌組織中己糖激酶-Ⅱ表達(dá)陽性率顯著高于對照組(P<0.01)。腫瘤大小、分化程度、合并腫瘤分期與己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)呈正相關(guān)(P值分別為P=0.001,P=0.000,P=0.019),而淋巴轉(zhuǎn)移與否與己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)無相關(guān)性(P=0.815)。結(jié)論:直腸癌組織中HK-Ⅱ呈高表達(dá),HK-Ⅱ抑制劑能抑制腫瘤糖酵解從而抑制腫瘤生長、增殖,促進(jìn)腫瘤凋亡,為腫瘤治療提供契機(jī)。

    [關(guān)鍵詞]直腸癌;己糖激酶-Ⅱ;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng);蛋白質(zhì)印跡法;免疫組織化學(xué)法

    2000年Hanahan等[1]在Cell雜志上提出了能量代謝失衡是腫瘤細(xì)胞特征之一。而己糖激酶(hexokinase,HK)是糖酵解的關(guān)鍵限速酶,能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖,為惡性腫瘤細(xì)胞提供能量從而促進(jìn)腫瘤的生長及增殖。HK家族有多種亞型,大多數(shù)惡性腫瘤在HK-II亞型中呈高表達(dá)。國內(nèi)外在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等方面有所探討,但在直腸癌中目前相關(guān)資料比較少。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)、免疫組織化學(xué)法了解己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá),并分析其與腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移等臨床特征之間的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1一般資料直腸癌根治術(shù)100例腫瘤新鮮標(biāo)本、癌組織石蠟標(biāo)本及距離腫瘤2cm癌旁組織的石蠟標(biāo)本,其中新鮮標(biāo)本于標(biāo)本離體后0.5小時內(nèi)放入液氮中保存。入組標(biāo)準(zhǔn):(1)病理診斷明確,病理分期采用美國腫瘤研究聯(lián)合會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)共同制定公布的第7版TNM分期;(2)患者未接受術(shù)前化療或放療;(3)患者均知情同意。

    1.2方法

    1.2.1RT-PCR:按試劑說明行RNA提取,取2μgRNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;HK-II及GAPDH引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。HK-II(442bp)上游引物:5’-GGC AAT GAA ACC AAA GCC AGG AG-3’,下游引物:5’-GGA AGG AGG AGC CAG AAG CAA CC-3’;GAPDH(715bp)上游引物:5’-CAA ATT CCA TGG CAC CGT CA-3’,下游引物:5’-GGA GTG GGT GTC GCT GTT GA-3’;每對引物均位于不同的外顯子,避免擴(kuò)增包含基因組DNA,管家基因GAPDH作內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序(HK-II):94℃預(yù)變性5min,94℃1min,58℃45s,72℃1min,35個循環(huán),4℃恒溫保存。PCR反應(yīng)程序(GAPDH):94℃預(yù)變性5min,94℃45s,58℃45s,72℃45s,35個循環(huán),4℃恒溫保存。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描拍照。

    1.2.2Western-blot印跡法:提取直腸癌組織及癌旁正常組織蛋白,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定腫瘤細(xì)胞蛋白濃度。然后行蛋白電泳,電泳凝膠有10%分離膠和5%濃縮膠,每孔上樣60μg蛋白進(jìn)行電泳。電泳電壓為40V,待溴酚蘭電泳進(jìn)入至分離膠后,將電壓提高至60V,直至溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板底部時則停止電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。放于室溫下晾干至過夜,DAB染色1~5min,出現(xiàn)清晰條帶時終止顯色,凝膠電泳圖像掃描儀進(jìn)行掃描及圖像分析。

    1.2.3免疫組化法檢測:將石蠟切片標(biāo)記好后脫蠟及水化,采用檸檬酸鈉法進(jìn)行抗原修復(fù),用濕切片筆將石蠟組織圈起來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗除去多余非特異性抗原,加兔抗人單克隆抗體,滴加DAB顯色液,用蘇木素核復(fù)染后脫水和透明,鏡下觀察免疫組化結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片選擇5個高倍視野(10×20),計數(shù)不少于500個細(xì)胞,取均數(shù)并評分。不著色為0分,淡色為1分,深色為2分。著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分比:<5%為0分,6%~25%為l分,26% ~50%為2分,>51%為3分。染色程度與染色細(xì)胞百分比乘積為最終計算結(jié)果,乘積>1分陽性。兩組應(yīng)用ImageProPlus軟件采用定量法分析實驗切片,隨機(jī)選取5個高倍視野,計算單位陽性面積IOD值(積分光密度值),比較兩組間差異。該值越低,表明切片透光性越弱,染色越深,即切片陽性染色顆粒越多,反映染色陽性的HK-Ⅱ蛋白越多。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,計量指標(biāo)采用x-±s表示,組間差異性比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1RT-PCR檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在RNA水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)(圖1)。

    圖1 RT-PCR檢測結(jié)果

    2.2Western-blot檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在蛋白質(zhì)水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)(圖2)。

    圖2 Western-blot檢測結(jié)果

    2.3免疫組化檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在蛋白質(zhì)水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)(圖3)。

    2.4直腸癌組織與直腸組織中HK-II表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系見表1。

    圖3 免疫組化檢測結(jié)果(200×)

    表1 直腸癌組織與直腸組織中HK-II表達(dá)與患者臨床病理關(guān)系 例(%)

    3 討 論

    直腸癌在我國是常見的惡性腫瘤之一,目前其發(fā)病率有逐年上升的趨勢,平均年遞增速度約為4.2%[2]。直腸癌的發(fā)病與飲食、環(huán)境、炎性腸病、遺傳、結(jié)腸息肉等多種因素有關(guān)。近年來隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,可從基因水平進(jìn)一步揭示直腸癌發(fā)病原因。1931年Warburg發(fā)現(xiàn)[3],惡性腫瘤優(yōu)先利用糖酵解釋放的能量來滿足細(xì)胞的需要。也就是說腫瘤細(xì)胞即使氧氣供應(yīng)充足,能夠比正常組織把更多的葡萄糖代謝為乳酸,即所稱的Warburg效應(yīng)。在哺乳類動物的體內(nèi),一共有4種亞型的己糖激酶,其中HK-Ⅱ與惡性腫瘤關(guān)系密切。HK-Ⅱ的升高對于促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解具有重要的意義,有力的糖酵解和生物合成代謝途徑,為腫瘤在宿主組織內(nèi)不受控制的增殖提供了正性的支持[4-5]。研究表明分化型結(jié)腸癌氧化磷酸化比例高于未分化型,未分化型結(jié)腸癌細(xì)胞中糖酵解比例升高,因此HK-Ⅱ可能是腫瘤生長速率的指標(biāo)[6]。對人類結(jié)腸癌移植腫瘤中不同移植瘤的分析表明,結(jié)腸癌中HK-Ⅱ活性的差異與腫瘤生長具有相關(guān)性,可作為腫瘤生長速率指標(biāo)[6]。因此己糖激酶對于惡性腫瘤細(xì)胞的生存起著重要的作用。

    本實驗在基因水平和蛋白水平,檢測HK-Ⅱ在直腸癌切片中的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn),在直腸癌組織中HK-Ⅱ表達(dá)陽性率明顯高于正常直腸組織。證實在直腸癌組織中HK-Ⅱ明顯高表達(dá),與其他文獻(xiàn)結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)在癌組織中,HK-Ⅱ的高表達(dá)與腫瘤的大小、組織分化及臨床病理Dukes分期間呈明顯正相關(guān)。HK-Ⅱ的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無明顯相關(guān)性,分析發(fā)現(xiàn)部分肝轉(zhuǎn)移病例淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移,考慮這可能影響統(tǒng)計分析。結(jié)果證明腫瘤越大,HK-Ⅱ的表達(dá)越高,表明在較大的腫瘤中存在較強(qiáng)的無氧糖酵解。結(jié)果證明分化程度越低,HK-Ⅱ表達(dá)越高,表明在分化較差的腫瘤中糖酵解增強(qiáng)。結(jié)果證明腫瘤臨床分期的越晚,HK-Ⅱ陽性表達(dá)率越高。

    氯尼達(dá)明等藥物抑制HK來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,HK的抑制劑在早期動物試驗中已經(jīng)取得一定的成果[7-8]。但是關(guān)于HK-Ⅱ與腫瘤的關(guān)系主要是來自腫瘤細(xì)胞株,而目前以患者為對象的研究少見。本實驗研究結(jié)果顯示,直腸癌組織中HK-Ⅱ呈高表達(dá),假如使用HK-Ⅱ抑制劑來抑制腫瘤糖酵解從而抑制腫瘤生長、增殖,促進(jìn)腫瘤凋亡,此可為腫瘤的治療提供了契機(jī),很可能成為當(dāng)今腫瘤研究的一個新熱點(diǎn)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Hanahan D,Weinberg RA. Hall marks of cancer:the next Generation[J]. Cell,2011,144(5):646-674.

    [2]任東林,郭學(xué)峰.新輔助治療在直腸癌治療中的應(yīng)用和評價[J].醫(yī)學(xué)新知雜志,2008,18(2):68-70.

    [3] Warburg O. On the origin of cancer cells[J].Science,1956,123(3191):309-314.

    [4] Pedersen PL,Mathupala S,Rempel A,et al. Mitochondrial bound type II hexokinase:a key player in the growth and survival of many cancers and an ideal prospect for therapeutic intervention[J]. Biochim Biophys Acta,2002,1555(1/ 3):14-20.

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    [7] Ko YH,Pedersen PL,Geschwind JF. Glucose catabolism in the rabbit VX2 tumor model for liver cancer:characterization and targeting hexokinase[J]. Cancer Lett,2001,173(1):83-91.

    [8] Geschwind JF,Georgiades CS,Ko YH,et al. Recently elucidated energy catabolism pathways provide opportunities for novel treatments in hepatocellular carcinoma[J]. Expert Rev Anticancer Ther,2004,4(3):449-457.

    The clinical value of Hexokinase-II expression in carcinoma of the rectum

    GONG Hai,SHI Xin,LIU Shuanghai

    (Department of Anorectal Surgery,Jiangyin Hospital Affiliated to Nantong University,Jiangsu 214400)

    [Abstract]Objective:To study the expression of Hexokinase-II in carcinoma of the rectum,and analyze the relationships between HK-II expression and the clinical features. Methods: The expression of HK-II in 100 carcinoma of the rectum tissue was checked by using reverse transcriptase polymerase chain reaction,Western blot and inununohistochemistry technique.Then the relationships between HK-II expression and the clinical features of carcinoma of the rectum patients were further investigated,such as tumor sizes,clinical stages,differentiation levels,lymphatic metastasis. Results:RT-PCR result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on RNA level.Western blot result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on protein level.Inununohistochemistry results showed that the cancer tissue had more positive expression than normal rectal mucosa tissue(P=0.000).Inununohistochemistry results showed that tumor sizes,differentiation levels and merger of tumor stages was related with positive expression HK-II(prespectively 0.001,0.000,0.019),lymphatic metastasis was not related with positive expression HK-II(P=0.815). Conclusions:The cancer tissue had more positive HK-II expression than normal rectal mucosa tissue. Tumor sizes,clinical stages and differentiation levels were related with positive expression of HK-II,lymphatic metastasis was not related with positive expression of HK-II.

    [Key words]carcinoma of the rectum;Hexokinase-II;reverse transcriptase polymerase chain reaction;Westernblot;Inununohistochemistry

    [收稿日期]2014-10-22

    * [作者簡介]龔海,男,漢族,江蘇江陰人,生于1973年9月,本科,副主任醫(yī)師。研究方向:結(jié)直腸肛門病外科。

    [文章編號]1006-2440(2015)01-0020-04

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    [中圖分類號]R735.3+7

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