利巴韋林發(fā)酵過程中腺嘌呤限量供應(yīng)的初步研究*

劉莉，王法松，李燕軍，謝希賢，陳寧

1(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

利巴韋林(Ribavirin)是一種高效廣譜的核苷類抗病毒藥物，被應(yīng)用于治療多種病毒感染如小鐵腺病毒肺炎、病毒性肝炎、呼吸道合胞病毒感染等［1］。發(fā)酵法是利用核苷生產(chǎn)菌自身產(chǎn)生前體物鳥苷和嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)，向培養(yǎng)基中添加1，2，4-三氮唑-3-羧甲酰胺(TCA)合成利巴韋林(見圖1)。目前，對發(fā)酵法合成利巴韋林的研究主要集中于菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化，而培養(yǎng)基優(yōu)化也主要是考察無機(jī)鹽的作用，對于關(guān)鍵生長因子的功能研究較少［2-4］。

磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶是嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶，其活力的高低直接影響嘌呤合成途徑的通量［5］，是評(píng)價(jià)利巴韋林生產(chǎn)能力的指標(biāo)之一。PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶催化嘌呤合成途徑中PRPP轉(zhuǎn)化為1-氨基-5-磷酸核糖(PRA)，該酶受腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)及鳥苷酸(GMP)的阻遏，同時(shí)它還受到AMP系和GMP系中任一物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒簦?］。如圖1所示，在 B.amyloliquefaciens TA208-LM 中 IMP、GMP被不斷利用，不會(huì)出現(xiàn)過度積累的現(xiàn)象，因此不會(huì)阻遏PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的合成。本研究所用利巴韋林生產(chǎn)菌株B.amyloliquefaciens TA208-LM為腺嘌呤缺陷型菌株［7］，切斷了肌苷酸到腺苷琥珀酸的支路。但AMP可以通過補(bǔ)救途徑合成，指細(xì)胞利用培養(yǎng)基中的腺嘌呤在酶的作用下直接合成AMP［8］。腺嘌呤含量不足會(huì)影響菌體生長，過多會(huì)轉(zhuǎn)化為大量的AMP，進(jìn)而阻遏PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶合成。因此腺嘌呤的用量是影響利巴韋林積累的關(guān)鍵因素［9-12］。

圖1 B.amyloliquefaciens TA208-LM中嘌呤核苷酸生物合成的反饋控制機(jī)制Fig.1 The feedback control mechanism of purine nucleotide biosynthesis in B.amyloliquefaciens TA208-LM

培養(yǎng)基中腺嘌呤主要來源于酵母抽提物，但酵母抽提物因不同廠家及產(chǎn)地質(zhì)量均有不同，利巴韋林產(chǎn)量很容易受到腺嘌呤供體酵母抽提物質(zhì)量的影響，很難保證發(fā)酵的穩(wěn)定性。本研究采用搖瓶發(fā)酵對腺嘌呤供體酵母抽提物種類和用量進(jìn)行確定，對發(fā)酵過程中所需腺嘌呤量進(jìn)行了優(yōu)化，并在發(fā)酵罐上研究了腺嘌呤限量供應(yīng)的作用，為今后利巴韋林生產(chǎn)提供一定指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

利巴韋林生產(chǎn)菌Bacillus amyloliquefaciens TA208-LM由天津科技大學(xué)代謝工程驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 1，蛋白胨10，牛肉膏 10，酵母膏 5，NaCl 2.5，瓊脂 20，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20，豆餅水解液 20，酵母粉 10，玉米漿 30，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 1，KH2PO41，味精 5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80，酵母粉 18，豆餅水解液 42，玉米漿 23，(NH4)2SO415，MgSO4·7H2O 8，K2HPO42.5，味精 15，MnSO40.006，F(xiàn)eSO40.012，無水 CaCl22.5，D-葡萄糖酸鈉 2，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜Agilent 1200，美國安捷倫;7.5 L BioFlo 115自動(dòng)控制發(fā)酵罐，美國NBS公司。

1.3 磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶的活性檢測:

粗酶液的制備、蛋白質(zhì)定量分析和PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的活性測定參見文獻(xiàn)［13］。

1.4 游離和水解氨基酸樣品制備

取1 g酵母抽提物直接溶于去離子水中，13 000 r/min離心2 min，取1 mL上清液用于測定酵母抽提物中的游離氨基酸。

水解酵母抽提物采用安培管封管法，具體方法如下:稱取1 g的酵母抽提物于20 mL安培管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，用液氮冷凍，待液體超過1/3凝固后，抽真空，熔化安培管使其密封;110℃水解22 h;水解完成后，冷卻后過濾;取適量濾液置于濃縮儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，低于60℃，抽真空，蒸發(fā)至干;加入適量的去離子水溶解樣品，振蕩混勻，制得水解樣品。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng):將B.amyloliquefaciens TA208-LM菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量為30 mL的種子培養(yǎng)基中(500 mL搖瓶)，36℃培養(yǎng)10 h后以10%接種量接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(500 mL搖瓶)，每組3個(gè)平行。36℃培養(yǎng)，發(fā)酵周期為60 h，期間補(bǔ)加葡萄糖。每12 h添加20 g TCA，共添加3次。

7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng):將菌株經(jīng)斜面活化后接種于裝液量為4×100 mL的種子培養(yǎng)基中(1 L搖瓶)，36℃培養(yǎng)10 h后將種子培養(yǎng)基按10%接入7.5 L發(fā)酵罐中(裝液量為4 L)。發(fā)酵過程中通過自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0左右，培養(yǎng)溫度為36℃。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降至一定值時(shí)，以設(shè)定脈沖速度將80%葡萄糖溶液流加至培養(yǎng)基中，以維持葡萄糖的濃度在菌體所需范圍內(nèi)。每12 h添加20 g TCA，共添加3次。

1.6 分析方法

1.6.1 菌體細(xì)胞生長量(DCW)和葡萄糖消耗量的測定

發(fā)酵過程中，取適量發(fā)酵液稀釋后用紫外分光光度計(jì)測定600 nm處的吸光度值。取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌菌體3次，置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱重。菌體生物量以干重(DCW)表示:1 OD600nm=0.245 g/L干菌體。葡萄糖濃度采用SBA-40C生物傳感儀測定。

1.6.2 高效液相色譜分析

高效液相色譜采用的離子柱Accurasil C18分別測定發(fā)酵液中利巴韋林、腺嘌呤含量以及酵母抽提物游離和水解樣品中氨基酸含量。以4%乙腈為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫18.5℃，檢測波長為207 nm，測定發(fā)酵液上清液中的利巴韋林。以0.2 mol/L KH2PO4為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫26℃，檢測波長260 nm，測定發(fā)酵液上清液中的腺嘌呤。以乙腈與醋酸鈉溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫33℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm，用 2，4-二硝基氟苯柱前衍生測定游離和水解樣品的氨基酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同腺嘌呤供體對利巴韋林發(fā)酵的影響

由于實(shí)驗(yàn)所用的B.amyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突變株，因此腺嘌呤是影響利巴韋林發(fā)酵的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基中腺嘌呤的主要來源是酵母抽提物，實(shí)驗(yàn)分別選取3種酵母抽提物(Springer 2506、FM 888、LM 800)，添加量為 18 g/L，考察不同來源的酵母抽提物對利巴韋林發(fā)酵的影響。搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見圖2，可見采用不同來源酵母抽提物發(fā)酵時(shí)菌體的生長情況和產(chǎn)物積累量有明顯差異。由圖2 A菌體干重曲線可知，利用Springer 2506時(shí)菌體有一個(gè)較長的對數(shù)期，在60 h達(dá)到最大生物量13.72 g/L，而利用FM 888和LM 800酵母抽提物都有一個(gè)相對較短的對數(shù)期，36 h進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵60 h達(dá)到其最大生物量10.98 g/L和11.68 g/L。另外，利用FM 888時(shí)發(fā)酵后期菌體有明顯衰退。分析3種酵母抽提物的氨基酸含量(見表1)和圖2 B葡萄糖消耗曲線可以看出Springer 2506所含氨基酸較其他2種高，消耗葡萄糖量最少。推測可能是其自身的氨基酸直接作為菌體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而減少了葡萄糖的消耗。從圖2 C發(fā)酵過程中利巴韋林積累量曲線可知，利用Springer 2506發(fā)酵60 h，利巴韋林積累量達(dá)到7.72 g/L，而利用FM 888和LM 800發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累量僅有5.13 g/L和6.44 g/L。結(jié)合圖2 D發(fā)酵過程中腺嘌呤含量變化，分析其與利巴韋林積累之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中后期3種酵母抽提物提供的腺嘌呤含量越低，利巴韋林的積累量也越低。通過圖2 D發(fā)現(xiàn)Springer 2506對腺嘌呤具有緩釋作用，腺嘌呤濃度既滿足了菌體的生長需要，又不會(huì)在發(fā)酵中后期濃度過低，因此利巴韋林和菌體可大量積累。綜上所述，利用Springer 2506對菌體生長和產(chǎn)物積累最有利，確定Springer 2506作為利巴韋林發(fā)酵的腺嘌呤供體。

圖2 添加不同酵母抽提物利巴韋林搖瓶發(fā)酵的各參數(shù)比較Fig.2 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different yeast extracts

表1 三種酵母抽提物中游離和水解氨基酸含量、游離腺嘌呤含量Table 1 Contents of amino acids and adenines in water solutions，and releasedamino acids in acid hydrolysates of three yeast extracts

2.2 Springer 2506濃度對利巴韋林發(fā)酵的影響

由于B.amyloliquefaciens TA208-LM是腺嘌呤缺陷型突變株，因此腺嘌呤的用量是影響利巴韋林發(fā)酵的關(guān)鍵因素。基于上個(gè)實(shí)驗(yàn)確定Springer 2506是腺嘌呤的最佳供體，實(shí)驗(yàn)分別選取4個(gè)濃度(10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)考察不同濃度的 Springer 2506對利巴韋林發(fā)酵的影響，搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見圖3。由圖3可看出，不同濃度的Springer 2506發(fā)酵時(shí)菌體的生長情況和產(chǎn)物積累量有明顯差異。從圖3 A菌體干重曲線和圖3 B葡萄糖消耗曲線可以看出隨著Springer 2506濃度的增加菌體生物量和耗糖也有明顯增加。從圖3 C發(fā)酵過程中利巴韋林積累曲線可以看出，Springer 2506濃度為15 g/L時(shí)，發(fā)酵過程利巴韋林積累量最高，達(dá)到8.94 g/L;當(dāng)濃度大于15 g/L時(shí)，利巴韋林積累量逐步降低。結(jié)合圖3 D發(fā)酵過程中腺嘌呤含量變化，分析其與利巴韋林積累之間的聯(lián)系，發(fā)酵中后期腺嘌呤含量過低或過高都會(huì)影響利巴韋林的積累量。推測出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因是Springer 2506在發(fā)酵過程中緩慢釋放腺嘌呤，導(dǎo)致后期腺嘌呤過量，加快菌體生長，大量的葡萄糖流向EMP途徑，使得合成利巴韋林的代謝通量減弱。

圖3 添加不同濃度Springer 2506的利巴韋林搖瓶發(fā)酵各參數(shù)比較Fig.3 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different concentrations of Springer 2506

磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)酰胺酶是嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶，該酶活性的高低直接影響進(jìn)入核苷合成途徑的通量。對于B.amyloliquefaciens TA208-LM(見圖2)來說，自身不能合成AMP，由于補(bǔ)救途徑的存在，腺嘌呤會(huì)轉(zhuǎn)化成AMP，進(jìn)而影響PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性，因此培養(yǎng)基中酵母抽提物所提供的腺嘌呤就成為影響PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的關(guān)鍵。由圖4 A可以看出Springer 2506濃度為15 g/L下PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力最高，因此進(jìn)入核苷合成途徑的通量也就越大。圖4 B表明在添加15 g/L Springer 2506的發(fā)酵過程中PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性隨發(fā)酵時(shí)間而逐漸降低，而圖3 D所示在發(fā)酵36 h后腺嘌呤含量逐步升高。原因可能是發(fā)酵中后期腺嘌呤含量上升，除了導(dǎo)致上述代謝溢流外，同時(shí)降低了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性，進(jìn)而影響利巴韋林的合成。綜上所述，在利巴韋林發(fā)酵過程中，控制Springer 2506濃度為15 g/L，可以避免高濃度的腺嘌呤對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏和代謝溢流，有利于利巴韋林的積累。

圖4 PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性比較Fig.4 Comparison of enzyme activities of PRPP amidotransferase

2.3 不同初始腺嘌呤濃度對利巴韋林積累的影響

酵母抽提物富含多種發(fā)酵所需的生長因子，前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其在利巴韋林發(fā)酵過程中難以被取代。本研究使用的Springer 2506對腺嘌呤具有緩釋作用，導(dǎo)致發(fā)酵后期腺嘌呤濃度過高(圖3D)，影響了PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力。為了穩(wěn)定發(fā)酵過程中的腺嘌呤含量維持較高的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，既滿足菌體生長又不會(huì)帶來過高腺嘌呤濃度，降低Springer 2506的初始濃度，額外添加腺嘌呤，研究不同初始腺嘌呤濃度對利巴韋林積累的影響。初始培養(yǎng)基中以1%Springer 2506為基礎(chǔ)，額外添加不同濃度的腺嘌呤，即培養(yǎng)基中初始腺嘌呤總量分別為39.97、43.37、47.95、61.36、67.04 mg/L，搖瓶發(fā)酵各參數(shù)見圖 5。

由圖5 A菌體干重曲線和圖5 B葡萄糖消耗曲線可知，隨著初始腺嘌呤含量的增加，生物量和耗糖也隨之增加。從圖5 C發(fā)酵過程中利巴韋林積累曲線可以看出，當(dāng)發(fā)酵液中初始腺嘌呤濃度為39.97～47.95 mg/L時(shí)，利巴韋林產(chǎn)量隨著腺嘌呤濃度的增加而增加;當(dāng)初始腺嘌呤濃度為47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累最高，達(dá)到8.14 g/L;但當(dāng)初始腺嘌呤濃度高于47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵60 h時(shí)利巴韋林積累量明顯降低。

圖5 不同初始腺嘌呤濃度下利巴韋林的搖瓶發(fā)酵各參數(shù)比較Fig.5 Comparison of parameters in ribavirin shake-flask fermentation under different initialconcentrations of adenine

結(jié)合圖5D發(fā)酵液中腺嘌呤的含量曲線和圖6A分析，發(fā)酵液中腺嘌呤含量對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶有明顯影響，但比15 g/L Springer 2506下發(fā)酵液中腺嘌呤含量有明顯降低，PRPP酶活力也有所提高。結(jié)合圖5D和圖6B分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中后期維持發(fā)酵液中腺嘌呤含量在40～50 mg/L有利于維持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力。綜上所述，降低初始酵母抽提物濃度額外添加腺嘌呤，有利于發(fā)酵中后期腺嘌呤濃度維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，保持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，進(jìn)而提高利巴韋林積累量。

圖6 PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活性比較Fig.6 Comparison of enzyme activities of PRPP amidotransferase

2.4 Springer 2506分批補(bǔ)料發(fā)酵過程分析

前期工作中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中較高的腺嘌呤含量有益于菌體生長，較低的腺嘌呤含量有利于解除對關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏作用，提高利巴韋林積累量。采用不同工藝條件進(jìn)行7.5 L分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵開始時(shí)添加一定濃度的Springer 2506用于菌體生長，發(fā)酵6 h開始以1.5 g/(L·h)的速率流加不同濃度的Springer 2506，通過限制發(fā)酵液中腺嘌呤的含量，解除其對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的阻遏?？疾炝瞬煌桨笇晚f林發(fā)酵的影響。試驗(yàn)結(jié)果見表2和圖7。

方案1:15 g/L的Springer 2506直接添加到培養(yǎng)基中，不流加;

方案2:7.5 g/L的Springer 2506為底物，流加7.5 g/L的Springer 2506;

方案3:3 g/L的Springer 2506為底物，流加12 g/L的 Springer 2506。

表2 Springer 2506不同添加方案下利巴韋林分批補(bǔ)料發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 2 Comparison of parameters in fed-batch ribavirin fermentationunder different Springer 2506 feeding programs

圖7 不同Springer 2506添加方案下發(fā)酵過程菌體比生長速率和利巴韋林比生產(chǎn)速率Fig.7 Kinetic parameters of ribavirin fermentation on specific growth rate and specific ribavirin production rate under different Springer 2506 feeding programs

結(jié)合表2和圖7可知，隨初始培養(yǎng)基中腺嘌呤供體Springer 2506濃度不同，菌體生物量及利巴韋林的積累量有明顯差異。方案1和方案2獲得的最大生物量差異不大，分別為6.71 g/L和6.31 g/L，但方案2中后期比生長速率緩慢下降;方案2有較高的比生產(chǎn)速率，與方案1相比利巴韋林積累量高出11.29%。方案3獲得的最大生物量僅有5.69 g/L，有較低的比生長速率，與方案1相比利巴韋林積累量降低7.15%。在方案2下，腺嘌呤維持在合適濃度范圍，導(dǎo)致PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力較高，從而以較高的生產(chǎn)速率合成利巴韋林?？梢姡m當(dāng)?shù)販p少初始Springer 2506的濃度，通過流加酵母抽提物，有利于提高利巴韋林的合成速率。

3 結(jié)論

本研究通過搖瓶實(shí)驗(yàn)確定了Springer 2506是利巴韋林發(fā)酵的最佳腺嘌呤供體，用量在15 g/L時(shí)最有利于利巴韋林積累。在15 g/L Springer 2506的條件下，發(fā)酵中后期PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力顯著下降，說明發(fā)酵液中腺嘌呤含量仍是過高。為了降低發(fā)酵過程中的腺嘌呤含量維持PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力，在既滿足菌體生長又不會(huì)帶來過高腺嘌呤濃度的前提下降低Springer 2506的初始濃度，額外添加腺嘌呤，發(fā)現(xiàn)初始腺嘌呤總量為47.95 mg/L時(shí)，發(fā)酵液中腺嘌呤含量維持在40～50 mg/L，PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力最高，合成利巴韋林的量最大。在分析以上發(fā)酵過程曲線的基礎(chǔ)上，認(rèn)為控制腺嘌呤供體酵母抽提物的初始濃度、對數(shù)生長期時(shí)流加酵母抽提物，可能為有效的腺嘌呤供應(yīng)方式。采用以7.5 g/L Springer 2506為底物，流加7.5 g/L的Springer 2506的方式分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)利巴韋林，比一次性添加15 g/L的Springer 2506，利巴韋林的積累量提高11.29%。

1976年Ochiai等［14］首次提出發(fā)酵法，核苷生產(chǎn)菌自身產(chǎn)生前體物鳥苷和表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶，只向培養(yǎng)基中添加TCA，即可實(shí)現(xiàn)利巴韋林的合成。由于菌株自身的嘌呤核苷磷酸化酶活性低，利巴韋林產(chǎn)量僅有0.28 g/L。2007年武改紅等［4］利用枯草芽孢桿菌TM903作為利巴韋林生產(chǎn)菌，優(yōu)化培養(yǎng)基成分、前體物TCA、培養(yǎng)溫度及pH等條件，發(fā)酵結(jié)束時(shí)利巴韋林僅有5 g/L。而本研究所用的菌株B.amyloliquefaciens TA208-LM能高效表達(dá)嘌呤磷酸化酶，彌補(bǔ)早期實(shí)驗(yàn)中嘌呤磷酸化酶活性不足的問題。此外，經(jīng)本工藝優(yōu)化，利巴韋林積累量最高達(dá)到8.94 g/L。由此可見，采用腺嘌呤限量供應(yīng)的發(fā)酵工藝能夠顯著提高利巴韋林產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)利巴韋林的發(fā)酵過程控制提供借鑒。

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