EPHB6的缺失突變del915-917促進非小細胞肺癌細胞的遷移

于 軍，鐵 茹，張學策，常 盼，趙 鴿，陳寶瑩(西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中心實驗室，西安 7008;西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科;第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院放射科;通訊作者，E-mail:pclamper@6.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型［1，2］，而遠端轉(zhuǎn)移是NSCLC患者的主要死亡原因。受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在NSCLC 的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用［3，4］。目前，大家最熟悉的與腫瘤轉(zhuǎn)移表型相關的RTK是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及其家族的成員 ERBB2/Her2、ERBB3和 ERBB4。因此，以EGFR為代表的RTKs成為腫瘤分子靶向治療的靶點［3，5］。EPH 是RTKs中最大的一個亞家族。到目前為止，脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了16種EPH分子，分為EPHA受體1-10(EPHA1-A10)和EPHB受體1-6(EPHB1-B6)［6，7］。EPHB6 受體與其配體 Ephrin相互作用。當與其配體Ephrin相互作用后，EPH受體調(diào)控一系列的細胞生物學行為，包括細胞與細胞的相互作用、細胞遷移等［8，9］。EPHB6缺失與晚期的NSCLC和癌癥的進展密切相關［10-16］。有報道顯示，EPHB6高表達是神經(jīng)母細胞瘤預后良好的標記［10，12］。而且，在轉(zhuǎn)移的黑色素瘤和具有轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌細胞系中EPHB6的mRNA表達降低［14-16］。在功能上，EPHB6抑制培養(yǎng)的乳腺癌細胞的侵襲、生長和克隆形成［17-18］，調(diào)控細胞黏附與遷移［19］。

一些RTKs的表達水平與早期NSCLC的轉(zhuǎn)移密切相關，多數(shù)RTKs的mRNA高表達與NSCLC轉(zhuǎn)移正相關，而EPHB6高表達與NSCLC的轉(zhuǎn)移負相關［20］。最近，我們 EPHB6在 NSCLC中甲基化沉默，而且其再激活能夠抑制NSCLC轉(zhuǎn)移［21］。我們通過測序篩查 EPHB6編碼區(qū)的序列，發(fā)現(xiàn)了EPHB6 一個新的突變 del915-917［22］，但其功能不明，本研究在肺腺癌細胞系A549中評價EPHB6的缺失突變del915-917的功能。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

本研究用到的NSCLC細胞的培養(yǎng)按照以往的方法進行［21］。A549肺腺癌細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的孵箱中，采用 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，Invitrogen，Carlsbad，CA)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基補充10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)、1%的青鏈霉素。HTB56、HTB58細胞于37℃、5%CO2的孵箱中，采用 MEM(Modified Eagle’s medium，Invitrogen，Carlsbad.CA)培養(yǎng)基。補充10%FCS、1%的青鏈霉素、1%的谷氨酰胺、1%的丙酮酸鈉和1%的非必需氨基酸。

1.2 定點突變

將人EPHB6的cDNA編碼區(qū)(base 833-3853 NCBI Accession No.NM_004445)克隆進入pcDNA4 To/myc/hisA表達載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。EPHB6的突變采用QuickChange XL定點突變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。以pcDNA4-EPHB6作為模板，上游引物為:5'-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG，下游引物為:5'-CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT。測序 Big-Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI3730xl自動 DNA測序儀上完成。測序得到的EPHB6編碼區(qū)序列與參考序列(GenBank accession No.NM_004445)進行比對，確認序列的正確性。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染和目的基因的表達

采用轉(zhuǎn)染試劑Nanofectin(PAA，Austria)轉(zhuǎn)染A549細胞，操作按照說明書進行。pcDNA4(空載體)、野生型EPHB6表達載體(pcDNA4-EPHB6-wt)或突變型EPHB6表達載體與EGFP的表達載體(pcDNA3.1-GFP，表達綠色熒光蛋白 EGFP)共轉(zhuǎn)染。為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，用700 μg/ml的G418(Sigma，St.Louis，MO，USA)和 400 μg/ml的Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進行篩選。利用流式細胞儀FACS對EGFP表達陽性的細胞進行分選。對得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞采用Western blot對于EPHB6的表達水平進行確認。

1.4 Western blot檢測EPHB6及其突變體的表達

采用Western blot檢測EPHB6及其突變體的表達，參照以往報道的方法進行［21，23］。小鼠抗人EPHB6 單克隆抗體(1 μg/ml，Abnova Corporation，Neihu，Taipei，Taiwan)、兔抗人 β-actin多克隆抗體(40 ng/ml，Sigma，USA)作為一抗，羊抗小鼠或羊抗兔多克隆抗體(Dianova，Hamburg，Germany)作為二抗。

1.5 細胞活力檢測

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.6 細胞遷移的檢測

將每孔5×105個A549細胞(懸浮于100 μl含5%FCS的DMEM培養(yǎng)基中)接種在用于細胞遷移檢測的Transwell?小室(濾膜直徑6.5 mm，濾孔的孔徑 6.5 mm，Corning Inc，Corning，NY)的上層。小室的下層加入600 μl含20%FCS的DMEM培養(yǎng)基。孵育(37℃、5%CO2)16 h，采用流式細胞儀對小室下層中的細胞計數(shù)。獨立的實驗至少重復3次，每次做3個復孔。

1.7 劃痕實驗

將A549細胞接種于25 ml的細胞培養(yǎng)瓶，接種密度為每瓶350 000個細胞，培養(yǎng)3 d，用10 μl移液器頭在單層融合細胞上面劃痕。更換新鮮的培養(yǎng)基，采用顯微錄像拍攝觀察傷痕的愈合過程。共拍攝觀察 17 h，每間隔 10 min拍攝一次，攝像機(ZEISS light microscope Axiovert 40C)連接于 CCD攝像機(Hamamatsu)。圖像的采集采用HiPic 32圖像處理系統(tǒng)和WASAB軟件(Hamamatsu Imaging Software)，圖像分析采用Image J軟件。獨立的實驗重復3次。

1.8 細胞大小分析

分別將空載體對照、穩(wěn)定表達野生型、突變性EPHB6的A549細胞接種于預包被膠原的細胞培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)5 h，使細胞貼壁，采用顯微錄像拍攝系統(tǒng)觀察細胞。攝像機(ZEISS light microscope Axiovert 40C)連接于CCD攝像機(Hamamatsu)。圖像的采集采用HiPic 32高效圖像控制系統(tǒng)(High Performance Image Control System)和 WASAB軟件(Hamamatsu Imaging Software)。對于細胞大小(μm2)的分析采用Image J軟件，按照以往的報道進行［24］。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 野生型EPHB6和突變體在A549細胞中的穩(wěn)定表達

為了研究EPHB6突變體的功能，我們分別構(gòu)建了EPHB6-wt、EPHB6-del915-917表達載體，分別轉(zhuǎn)染A549肺腺癌細胞，篩選得到穩(wěn)定表達的細胞。如圖1所示，以β-actin為內(nèi)參照，采用Western blot的方法檢測EPHB6及其突變體的表達情況，其中A549為沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞，A549-control為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA4的 A549細胞，A549EPHB6-wt和 A549EPHB6-del915-917分別為轉(zhuǎn)染EPHB6-wt、EPHB6-del915-917表達載體的A549細胞。結(jié)果 顯示，EPHB6-del915-917和EPHB6-wt的表達水平穩(wěn)定。

圖1 野生型和突變型EPHB6在A549細胞中的表達Figure 1 Expression of wild type and mutant EPHB6 in A549 cells

2.2 EPHB6-del915-917促進A549細胞的遷移

細胞遷移實驗采用美國Corning公司生產(chǎn)的細胞轉(zhuǎn)移培養(yǎng)板(Transwell migration plates)，將待測細胞接種于上下小室之間的膜上，比較穿過 Transwell?小室的細胞數(shù)發(fā)現(xiàn):和對照組比較，遷移到下層小室的A549EPHB6-wt和A549EPHB6-del915-917細胞均顯著增多(P＜0.05)。特別是，表達EPHB6突變體的細胞顯著多于表達野生型EPHB6的A549細胞(P ＜0.05，見圖2)。

圖2 突變型EPHB6對A549細胞的遷移的影響Figure 2 Effects of mutant EPHB6 on the migration of A549 cells

為了進一步確認細胞的體外遷移能力，我們進行了劃痕實驗。造成劃痕8 h后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPHB6-del915-917的A549細胞愈合3%，野生型EPHB6細胞劃痕愈合1.6%，轉(zhuǎn)染空載體的對照細胞愈合2%(見圖3)。與空載體對照相比，野生型的EPHB6能夠顯著抑制A549細胞的體外劃痕愈合，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPHB6-del915-917的A549細胞劃痕愈合速度顯著加快(見圖3)。表明 EPHB6突變不僅導致EPHB6抑制劃痕愈合的效應完全消失，而且其突變體具有顯著促進劃痕愈合的效應。

圖3 突變型EPHB6對NSCLC細胞劃痕愈合的影響Figure 3 Effects of mutant EPHB6 on the wound healing of A549 cells

2.3 EPHB6-del915-917不改變 A549細胞的增殖活力，但影響細胞大小

為了明確EPHB6突變是通過何種方式促進細胞遷移，我們進一步檢測了EPHB6突變對于細胞活力與細胞大小的影響。實驗結(jié)果顯示，各組細胞的MTT光吸收值無顯著差異(P＞0.05，見圖4)，表明EPHB6突變并不改變細胞的增殖活性(見圖4)，但明顯使細胞變小(P＜0.05，見圖5)。表明EPHB6通過改變細胞的大小，增強其遷移能力。

圖4 突變型EPHB6對A549細胞增殖活性的影響Figure 4 Effects of mutant EPHB6 on the proliferation of A549 cells

圖5 突變型EPHB6對細胞大小的影響Figure 5 Effects of mutant EPHB6 on the size of A549 cells

3 討論

EPH作為受體型酪氨酸蛋白激酶中最大的一個亞家族，其突變在腫瘤當中的發(fā)生比較頻繁。EPHB6 的體突變位點以往在結(jié)直腸癌［25，26］、肺癌［27］、卵巢癌［28］和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［26］中以往都有報道，但突變的功能不明。一項大樣本的測序研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中有10種EPH基因發(fā)生了突變［27］。由于EPH相關細胞信號網(wǎng)絡的復雜性，對于EPH突變的功能性作用及其后果還知之甚少，尤其缺少直接的實驗證據(jù)［29］。

我們以前的研究篩查了80例NSCLC患者和3例NSCLC細胞系，首次發(fā)現(xiàn)了3個未見報道的EPHB6突變位點［22］。其中，缺失突變 del915-917位于EPHB6酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與SAM結(jié)構(gòu)域之間。在結(jié)直腸癌中也報道此區(qū)域有EPHB6的突變發(fā)生［25，26］。這些研究均提示，該區(qū)域可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究通過細胞水平實驗發(fā)現(xiàn):EPHB6突變使NSCLC細胞跨膜遷移能力和劃痕愈合能力均顯著增強，表明 EPHB6突變促進NSCLC細胞遷移。該結(jié)果首次明確了EPHB6缺失突變del915-917在NSCLC轉(zhuǎn)移中的功能，且證實該突變位點所在的區(qū)域確實與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關系，這可能成為NSCLC診斷和治療的新靶點。

另外，本研究顯示 EPHB6突變不但造成EPHB6原有的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制效應消失，更重要的是其突變體具有促發(fā)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。其中一種可能的機制為突變體通過“顯性失活”的方式對野生型EPHB6產(chǎn)生抑制效應。另外，突變體還可能激活促細胞遷移的信號通路及其網(wǎng)絡，但這需要進一步的實驗驗證。

總之，NSCLC中多發(fā)EPHB6突變，并且EPHB6突變會促進NSCLC細胞遷移。這可能歸因于突變導致的EPHB6原有抗轉(zhuǎn)移功能的缺失，也可能是突變體具有新的促轉(zhuǎn)移功能，其確切機制還有待于進一步研究。

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