雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

金福源 陶艷華 李成貴 彭會建

（江蘇省蘇州市吳江區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 215200）

雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的，通過臨床癥狀進(jìn)行初步判斷，再根據(jù)其流行性和病理變化等初步診斷，確診還需要利用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行檢測。許多試驗(yàn)通過一些生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，RT-PCR、血清學(xué)試驗(yàn)、核苷酸測序等進(jìn)行分離鑒定病毒。傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定方法對IBV 進(jìn)行診斷會更加準(zhǔn)確，并且許多研究利用分離得到的病毒株可以研發(fā)出新型的疫苗和診斷試劑盒，為未來的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

SPF 雞胚（山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司）。

1.1.2 試驗(yàn)病料

取腎、肺、氣管等組織器官，或者急性期病雞氣管滲出物，制成懸浮液。（每毫升加青霉素和鏈霉素各1 萬IU，置4℃冰箱過夜，以抑制細(xì)菌污染）。

1.1.3 試驗(yàn)儀器和試劑

儀器：電泳儀；紫外燈儀；基因擴(kuò)增儀；單人凈化操作臺；37℃恒溫箱；臺式離心機(jī)；孵化機(jī)。

生化試劑Trizol Reagent；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均；瓊脂糖。胰蛋白酶 （濃度為1.47%）；雞紅細(xì)胞（濃度為0.8%）；青霉素和鏈霉素（濃度為940IU）；動物疫病基因芯片診斷試劑盒。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動物接種試驗(yàn)

將采集到的病料加入滅菌生理鹽水中進(jìn)行細(xì)細(xì)研磨，放入離心機(jī)中12000r/min 離心20min；之后再將上層清液用濾過膜過濾除菌，接種20 枚9 日齡SPF 雞胚，在尿囊腔中注入0.1ml/胚。觀察雞胚死亡情況，舍去一日內(nèi)死亡的雞胚，對1～6d 內(nèi)死雞胚進(jìn)行打蛋觀察雞胚的病變[1]。無菌條件下收集1～6d 內(nèi)死雞胚的尿囊液，接種10 日齡SPF 雞胚20 枚，連續(xù)傳3 代，再傳至10 代進(jìn)行備用。分離第3 代毒尿囊液，用肌肉注射的方式接種20 只SPF 雞，0.1ml/只，觀察SPF 雞的發(fā)病率和死亡率，對死亡雞進(jìn)行剖檢并觀察病理變化。

2.2 毒價測定

第3 代分離毒尿囊液用經(jīng)滅菌后的生理鹽水依次作10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7，4 個稀釋度分別接10～11 日齡SPF 雞胚10 枚，0.1ml/胚，孵育至144h。24h 以內(nèi)死亡的雞胚舍去，根據(jù)接種后24～144h 內(nèi)雞胚死亡的數(shù)量及144h 活胚中有特異性病理變化的雞胚總數(shù)計(jì)算毒價。

2.3 HA 試驗(yàn)

IBV 在雞胚中可干擾NDV-B1 株血凝素的產(chǎn)生[2]。取9～11日齡雞胚20 枚，分兩組，一組先尿囊液進(jìn)行接種被檢IBV 雞胚液；另一組作為對照。10～18h 后兩組同時進(jìn)行尿囊內(nèi)接種NDV-B1，孵化36～48h 后，置雞胚與4℃8h，取雞胚液做HA。

間接HA 試驗(yàn)陽性樣品用兔抗雞IBV 陽性血清測定血凝抑制（HI）效價。

2.4 RT-PCR 檢測

2.4.1 RNA 提取

（1）取被測樣品100μl，加300μlTirzol 裂解液，上下顛倒混勻，冰上靜置15min[2]；（2）加入氯仿后充分混勻，放在冰上靜置10min，然后4℃、12000r/min 離心20min；（3）取上清液250μl，加入250μl 異丙醇，充分混勻，置于冰上15min，然后4℃、12000r/min 離心20min；（4）舍去上清液，加入75%的乙醇1ml，然后4℃，12000r/min 離心10min，舍去上清液，放置5min；（5）加入15μlddH2O 除去沉淀，此時得到產(chǎn)物就是RNA 溶解液。

2.4.2 RT-PCR 擴(kuò)增體系

PCR 擴(kuò)增體系，見表1。

表1 PCR 擴(kuò)增體系

2.5 序列比對

將測序獲得的核苷酸序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析[3]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 動物接種試驗(yàn)結(jié)果

初代接種的雞胚，孵化至19d，可使少量雞胚發(fā)育受阻，有個別死亡的情況，而多數(shù)的雞胚能存活。雞胚連續(xù)傳至三代后，雞胚便出現(xiàn)規(guī)律性死亡現(xiàn)象，剖檢死雞胚可見雞胚蜷縮、矮小，出現(xiàn)“侏儒胚”的典型癥狀。臨床病料樣品接種第10代的9～11 日齡SPF 雞胚，接種后1～2d 內(nèi)雞胚全部死亡。收集死亡雞胚尿囊液作為分離毒株。

3.2 毒價測定結(jié)果

設(shè)置10-4、10-5、10-6、10-74 個稀釋梯度組，觀察雞胚死亡情況及特異性病痕的雞胚數(shù)量。如表2 所示，根據(jù)Reedmuench 法計(jì)算，得出該分離病毒的毒價為10-4.8/0.1ml。

表2 毒力測定結(jié)果

3.3 HA 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組雞胚液有49%以上HA 滴度在1:20 以下，對照組91%以上雞胚液HA 滴度在1:40 以上[2]。

分離出來的毒株進(jìn)行血凝試驗(yàn)，其中1%的雞紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集。病料的上清液接種雞胚，觀察雞胚存活情況是全部能存活。通過胰酶處理之后，血凝能夠被IBV 陽性血清抑制，HI效價在1：24～1：28；第一代的尿囊液進(jìn)行直接HA、間接HA試驗(yàn)，得到的結(jié)果均為陰性，并且胚體均發(fā)育正常，第二代到第十代第的尿囊液進(jìn)行直接HA 試驗(yàn)，試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性，間接HA 試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性。該病毒在雞胚上傳至第三代時，死雞胚或侏儒胚，隨傳代次數(shù)的增加萎縮癥狀呈現(xiàn)地越來越明顯。雞胚接種生理鹽水后，尿囊液都沒有出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集的現(xiàn)象，對照組雞胚的尿囊液平均HA 效價在1：28.3 之上，試驗(yàn)組的平均HA 效價在:1:24.6 之下，說明分離毒株干擾NDV 的增值。接種分離毒株的數(shù)量越多，干擾率會越高。從而初步判斷該尿囊液中分離物中有IBV。

3.4 RT-PCR 檢測結(jié)果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，可觀察到在427bp 處有特異的擴(kuò)增條帶，根據(jù)相關(guān)的報道分析可知[4]，表明分離毒為IBV，參見附圖。

3.5 分離毒株的序列分析結(jié)果

通過核苷酸序列的對比 [5]可以得到毒株基因的核苷酸序列與國內(nèi)廣泛使用的歐洲呼吸型疫苗株H52、H120 的各自的同源性可達(dá)到78.5%和78.7%；與美國呼吸型、腎型代表毒株M41、Holte 的同源性分別是78.9%和79.1%；與澳大利亞呼吸型株T 的同源性是78.3%；與國內(nèi)呼吸型疫苗株W93 的同源性為78.5%；與變異株5/91 的同源性為98.7%；同腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I 的同源性是75.5%；與臺灣地區(qū)的分離病毒株TW97-4 的同源性是78.5%。HP-W 株S1 基因編碼氨基酸的序列與變異株5/91 的同源性達(dá)97.2%，同其他毒株氨基酸序列的同源性都在79%之下。通過軟件分析可得該分離病毒株與現(xiàn)有的腎型、呼吸型疫苗株的親緣性都比較遠(yuǎn)，與變異株5/91 有很近的親緣性。

附圖 RT-PCR 結(jié)果

4 討論

雞傳染性支氣管炎的確定需要先通過臨床癥狀進(jìn)行初步判斷，再根據(jù)其流行性和病理變化等初步診斷，確診還需要利用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)行檢測。本次試驗(yàn)通過一些生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，RT-PCR、血清學(xué)試驗(yàn) [5]等進(jìn)行分離鑒定病毒，最后確定該養(yǎng)殖場雞群發(fā)病病因是IBV。傳統(tǒng)的病毒分離與鑒定方法對IBV進(jìn)行診斷會更加準(zhǔn)確，并且利用分離得到的病毒株可以研發(fā)出新型的疫苗和診斷試劑盒，為未來的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。由于IBV 血清型比較多且病毒變異速度較快，使用疫苗前要對當(dāng)?shù)亓餍械腎BV 血清型進(jìn)行調(diào)查，這樣得到的診斷和之后的防治才能更準(zhǔn)。

各種年齡的雞群都易感IBV，雞舍由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)、養(yǎng)殖密度大、通風(fēng)不佳、飼料營養(yǎng)不均衡等原因都會發(fā)生IBV 的感染?，F(xiàn)在IB 還沒有特效藥品，所以對其病的防控措施方法是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和疫苗接種。阻止應(yīng)激反應(yīng)，保證飼養(yǎng)環(huán)境和飼料的衛(wèi)生。預(yù)防該病的免疫程序一般為7～10 日齡弱毒疫苗首免，30 日齡弱毒疫苗二免，肌肉注0.4ml/只，并且要根據(jù)當(dāng)?shù)卦撘卟×餍星闆r選用合適的疫苗毒株。外來的雞群應(yīng)先隔離觀察一段時間，無癥狀的情況下再混入雞舍飼養(yǎng)。