ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展及乳源性ACE抑制肽的加工利用現(xiàn)狀

沈小璐，吳蘭芳，2，郭善廣，范萌萌，程偉偉，蔣愛民

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州510642；2.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊050200）

0 引言

近年來，生物活性肽已成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。這類肽大多相對分子質(zhì)量較小，在人體內(nèi)消化吸收較蛋白質(zhì)容易。不僅能提供人體生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)，還能調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能，起到預(yù)防、甚至治療疾病的作用[1]。目前發(fā)現(xiàn)的生物活性肽中所具有的功能包括降血壓、降脂、抗菌等。本文主要討論具有降壓效果的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽[2]。

食物蛋白來源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)獲得，食用安全性高，對高血壓患者可以起到降壓作用而對血壓正常者無降壓作用，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)、減肥等功能，有著合成化學(xué)藥物不可比擬的優(yōu)越性[3]。因此有必要對食物來源的ACE抑制肽進(jìn)行深入的研究，以期更好的獲得和人工合成優(yōu)良的ACE抑制肽。

1 ACE抑制肽的作用機(jī)制

1.1 ACE簡介

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Convert Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)，是含Zn2+輔基的二肽羧肽酶，屬于二價(jià)金屬酶一族，需由Zn2+和Cl－激活，相對分子質(zhì)量為120～150 ku。在哺乳動(dòng)物中，這種鋅相關(guān)的金屬酶參與血壓的升降。ACE固定于細(xì)胞膜表面，可表現(xiàn)為兩種形式，一種是體細(xì)胞形式（成年人ACE由1277個(gè)氨基酸分子組成）存在于內(nèi)皮、上皮和神經(jīng)元細(xì)胞中，另一種是較小的雄性生殖細(xì)胞形式。ACE是多功能酶，存在于體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotension systemun，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system,KKS)中[4]。

1.2 ACE抑制肽的降壓機(jī)制

正常人體內(nèi)的血壓受很多因素調(diào)節(jié)，其中最重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)是RAS和KKS，前者是升壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，后者是降壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對血壓的調(diào)節(jié)起著重要的作用，調(diào)節(jié)過程如圖1所示。

圖1 ACE在血壓調(diào)節(jié)中的作用

ACE是RAS中起重要作用的酶，它通過作用于該系統(tǒng)的中血管緊張素Ⅰ，使其脫去C末端兩個(gè)氨基酸(His-Leu)而轉(zhuǎn)變成為血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ是RAS中已知活性最強(qiáng)的血管收縮劑，它能作用于小動(dòng)脈，使血管平滑肌收縮，迅速引起升壓效應(yīng)；同時(shí)還能刺激醛固酮分泌和直接對腸胃作用(減少腎血流量及促進(jìn)Na+、K+的重吸收)，引起鈉貯量和血容量的增加，也能使血壓升高。另一方面，ACE也能作用于KKS降血壓系統(tǒng)中的緩激肽，緩激肽是降血壓物質(zhì)，ACE催化從緩激肽C末端脫去兩個(gè)氨基酸殘基而使其失活，從而削弱緩激肽的降血壓作用。如果抑制了ACE的活性，就能有效的防治高血壓的發(fā)生。降血壓肽能競爭性地抑制ACE的活性，從而阻斷RAS的升血壓作用，同時(shí)增強(qiáng)KKS的降壓作用，起到降低高血壓患者血壓的作用[4]。

2 ACE抑制肽的來源

自1965年Ferreira首次從南美洲蝮蛇(Bothropsjararaca)的毒液中發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑后，蛇毒中存在降血壓肽的研究引起了人們極大的興趣。因而，毒蛇中ACE抑制肽的發(fā)現(xiàn)具有重大醫(yī)療價(jià)值，人們已在體內(nèi)證實(shí)了毒蛇中ACE抑制肽能通過控制ACE活性達(dá)到預(yù)防與治療腎依賴型高血壓的效果[5]。

從食物來源上來看，ACE抑制肽主要來源于乳蛋白，動(dòng)、植物蛋白和發(fā)酵食品。大豆、乳品和水產(chǎn)品是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白源，且資源豐富，可作為提取ACE抑制肽原料，目前采用最多的是從牛奶蛋白中提取ACE抑制肽[3]。

3 ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定及構(gòu)效關(guān)系

3.1 ACE抑制肽的活性與分子大小有密切關(guān)系

通常認(rèn)為，肽分子量越小，其ACE抑制活性越高。代永剛等[6]人經(jīng)過超濾分離，制備的ACE抑制肽活性及IC50都有顯著提高。小于4 ku超濾液的ACE抑制活性比4～10 ku超濾液提高了13.22%，比原酶解液提高了17.63%。半抑制濃度比原酶解液提高了42.08%。Segura－Campos等[7]用豇豆分離蛋白酶解獲得ACE抑制肽，然后用4種截留分子量的超濾膜進(jìn)行超濾，并將ACE抑制活性最高的多肽段進(jìn)行凝膠過濾和RP－HPLC純化，結(jié)果表明相對分子質(zhì)量＜1 ku的多肽段具有最高的ACE抑制活性。Ryan等[8]在研究肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的時(shí)也可以看出大部分小分子的肽ACE抑制活性普遍高于大分子多肽。Fu-Yuan CHENG等[9]人在研究雞骨蛋白時(shí)也表明有水解物表現(xiàn)出的強(qiáng)的ACE抑制活性與那些小肽有關(guān)。但是，它們的關(guān)系也并非絕對，例如，二肽Try－Lys的分子量為300 u，其 IC50為1.63 μmol/L，而11 肽Met－Ile－Phe－Pro－Gly－Ala－Gly－Gly－Pro－Glu－Leu 分子量為1.3 ku，其 IC50為28.7 μg/mL，兩者均具有較強(qiáng)的ACE抑制活性[2]。

3.2 ACE抑制肽的活性與氨基酸序列結(jié)構(gòu)

目前，對于ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系還沒有完全研究透，但是很多的研究結(jié)果已有報(bào)到。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，ACE抑制肽活性與其自身特性有關(guān)。體細(xì)胞ACE（somaticACE，sACE）的C端催化部位包括三個(gè)子催化位點(diǎn)見圖2：S’、S1’和S2’，這三個(gè)位點(diǎn)分別與血管緊張素ⅠC-末端的三個(gè)疏水性殘基Phe-His-Leu相對應(yīng)。

圖2 ACE結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)C端氨基酸與ACE抑制肽的抑制活性有重要關(guān)系，C端為芳香族氨基酸和脯氨酸時(shí)其抑制活性較高[3]。

Ryan[8]等研究發(fā)現(xiàn)在倒數(shù)第二的位置，脂肪族（V，I，A），堿性（R）和芳香族（Y和F）氨基酸殘基是首選，而芳香族（W，Y和F）、脯氨酸（P）和脂肪族（A，L和M）殘基在肽C-末端的最終位置出現(xiàn)頻率較多。而且，C端殘基上帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸（ε-氨基）和精氨酸（胍基），可以顯著提高降壓肽的抑制活性。賈俊強(qiáng)等[10]通過收集270種降壓肽的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果疏水氨基酸和非疏水氨基酸在降血壓肽的N端出現(xiàn)的頻率相比僅多了6.6%，說明疏水氨基酸并不是降血壓肽的N端必須要有的氨基酸,而是隨機(jī)出現(xiàn)在降血壓肽的N端。與降血壓肽的N端氨基酸特征相比，其C端氨基酸特征對降血壓活性影響更為重要。Cheung等[11]研究也認(rèn)為ACE抑制肽的活性主要取決于C－端氨基酸，C－端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸時(shí)其抑制活性較高。

此外，段秀等[3]表明對于大于3個(gè)氨基酸長度的多肽，羥脯氨酸（Hyp）的存在是肽與ACE催化位點(diǎn)結(jié)合的關(guān)鍵。而且，肽的整體疏水性很重要，親水性肽具有弱的或沒有ACE抑制活性，因?yàn)橛H水性肽與ACE的活性部位是不相容的。事實(shí)上，ACE抑制作用是通過疏水性多肽與ACE子催化位點(diǎn)的高親和力來實(shí)現(xiàn)的。ACE抑制肽的作用不僅僅與C端三個(gè)氨基酸殘基有關(guān)，切割位點(diǎn)的N端殘基可能與ACE的關(guān)鍵子催化點(diǎn)相互作用。

3.3 ACE抑制肽的活性與氨基酸之間的構(gòu)象

短肽的生物活性除了與一級結(jié)構(gòu)氨基酸數(shù)量、種類和序列有關(guān)系之外，也與其構(gòu)象存在關(guān)系，但目前對于ACE抑制肽高級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系研究尚不深入。

王強(qiáng)等[12]在花生ACE抑制肽的研究中采用固相合成方法合成了具有相同氨基酸序列的短肽，并對合成肽活性進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)證實(shí)此種氨基酸序列的短肽具有明顯的體外ACE抑制活性，且合成短肽的活性高于花生蛋白源短肽KLYMRP。得出原因可能是ACE抑制肽各氨基酸之間可形成多種不同構(gòu)象，肽鏈的空間構(gòu)象與其功能活性也存在一定的相關(guān)性[13]。他們通過量子化學(xué)理論對ACE抑制肽的活性部位進(jìn)行了推測，初步探討了其ACE抑制活性與構(gòu)象的關(guān)系。通過短肽Lys-Leu-Tyr-Met-Arg-Pro(KLYMRP)的構(gòu)象優(yōu)化、短肽KLYMRP與ACE之間的相互作用分析表明，短肽KLYMRP與ACE活性位點(diǎn)的殘基形成5個(gè)氫鍵，一個(gè)Pi-Cation相互作用，并與鋅離子形成配位鍵，這些作用力共同穩(wěn)定了短肽-ACE復(fù)合物的構(gòu)象，從而有利于ACE抑制活性的發(fā)揮。

4 ACE抑制肽的定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）

目前國內(nèi)外ACE抑制肽的研究多集中于肽的制備、純化、序列測定、體內(nèi)/外活性評價(jià)等方面，對ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系研究也有一定進(jìn)展，但大多是一些定性描述。一般認(rèn)為ACE抑制肽C末端結(jié)構(gòu)對其競爭性結(jié)合于ACE上有著重要的影響，更傾向于C末端三肽的每個(gè)位置含有疏水性氨基酸。隨著不同結(jié)構(gòu)的ACE抑制肽不斷從食物蛋白水解液中分離出來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)有許多活性極強(qiáng)的肽并不滿足上述規(guī)律。因此，如何準(zhǔn)確表征ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)，預(yù)測肽的活性，闡明其作用機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)ACE抑制肽類藥物已成為目前亟待解決的問題[14]。

定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative Structure Activity Relationship，QSAR)作為一種定量描述活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的有效手段，具有量效關(guān)系明確、信息豐富、對未知化合物活性預(yù)測能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)的方法為功能食品的開發(fā)和創(chuàng)新提供了一種新的手段[15]。由于ACE抑制肽是一類相對分子質(zhì)量較小的短肽(一般低于1500)，對其結(jié)構(gòu)的定量描述不會過于復(fù)雜，因此具有可行性。對ACE抑制肽進(jìn)行QSAR研究將有助于深入理解肽的結(jié)構(gòu)特征以及活性機(jī)理。

劉靜等[16]收集20種天然氨基酸的457種理化性質(zhì)，按照疏水、電性特征、氫鍵貢獻(xiàn)和立體特征分類后，對它們分別進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，得到一個(gè)新的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)描述符SVHEHS。采用PLS算法進(jìn)行ACE抑制肽的QSAR建模研究，最后擬合出投影重要性指標(biāo)圖、主成分的得分分布散點(diǎn)圖、肽到模型X空間中心規(guī)格化距離圖、載荷貢獻(xiàn)散點(diǎn)圖、肽的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值關(guān)系圖等對樣本肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述。此描述符能用于ACE抑制肽的活性預(yù)測和分子設(shè)計(jì)，有利于ACE抑制肽的深入研究。

蘇淅娜等[14]采用氨基酸描述符SVHEHS(Scores Vector of Hydrophobic，Electronic，Hydrogen bonds and Steric Properties)對各肽樣本進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征后，進(jìn)行自交叉協(xié)方差(Auto Cross Covariances，ACC)處理，并分別利用多元線性回歸(Multiple linearregression，MLR)[15]、偏最小二乘(Partial least square regression，PLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial neural networks，ANN)3種建模方法進(jìn)行ACE抑制肽QSAR建模。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ANN與PLS模型的R2分別為0.958、0.862，Q2Loo分別為 0.948、0.829，Q2ext分別為 0.634、0.632，即ANN模型在擬合能力以及模型穩(wěn)健性方面更好，但其外部預(yù)測能力與PLS模型相差不大；而MLR模型的 R2、Q2Loo、Q2ext均較小，建模效果相對較差[14]。最終模型能對不同長度、活性差異大的肽進(jìn)行準(zhǔn)確的活性預(yù)測。

5 乳源性ACE抑制肽的加工利用

高血壓是我國主要的常見疾病之一，且呈數(shù)量逐漸上升、人群年輕化的趨勢，ACE抑制劑藥物在治療高血壓的過程中得到了公眾的認(rèn)可，但由于其對腎臟的毒副作用及對其他的一些副作用迫使人們尋找更加安全高效的ACE抑制劑，而從天然食物中分離到的ACE抑制肽正好符合這一特點(diǎn)[17]。

高血壓的治療應(yīng)從預(yù)防開始，ACE抑制肽可作為保健食品平時(shí)服用?，F(xiàn)階段，大部分的ACE抑制肽來自天然動(dòng)植物蛋白，提取方法多采用酶解，較為安全，這類食品人們的接受程度也較高。目前，日本是研究降壓肽最為深入的國家，酸奶飲品中添加降血壓肽作為保健飲品已在日本上市，形成了較為成熟的產(chǎn)業(yè)鏈[2]。

5.1 加工利用

乳及乳制品含有最豐富的動(dòng)物蛋白質(zhì)。研究表明，其不僅能給人提供豐富的營養(yǎng)，而且還是許多生物活性肽的重要來源，其中最具有開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值的是ACE抑制肽。自Maruyama等[18]于1982年從酪蛋白水解物中分離出具有ACE抑制活性的12肽(CEJ12)以來，各國研究人員采用不同的方法陸續(xù)從酪蛋白中分離提取出了更多的ACE抑制肽。乳及乳制品來源的抗高血壓活性肽成為乳品研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，現(xiàn)已在乳酪蛋白、乳清蛋白、發(fā)酵乳等[19-22]中發(fā)現(xiàn)了許多抗高血壓活性肽。HARTMANN R等[23]的研究總結(jié)也說明了目前國外以乳源蛋白為原料的降血壓產(chǎn)品越來越多。

1995年，Nakamura等人[24,25]用Lactobacillus helveti-cus和Saccharomyces cerevisiae作為發(fā)酵劑制作了一種名為Calpis的酸乳飲料。實(shí)驗(yàn)得出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，牛奶的ACE抑制活性增加；SHR長期服用Calpis后，可抑制血壓上升。王世賓等[26]通過對Evolus高鈣發(fā)酵乳（采用特殊菌種－瑞士乳桿菌發(fā)酵，）的研究表明：經(jīng)嚴(yán)格科學(xué)的工藝控制，得到高含量的降血壓短肽，可以起到降低血壓的作用。Evolus高鈣發(fā)酵乳與其他某些產(chǎn)品其降血壓優(yōu)越性更強(qiáng)，并且自身對人體收縮和舒張壓有明顯的降壓效果。除此之外，BLANCA H L等人[27-29]也研究制備了一些乳源降壓肽降壓產(chǎn)品并且驗(yàn)證了它們在臨床上的效果。

5.2 展望

通過對ACE抑制肽不斷深入的研究，更有利于掌握ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系，從而更好的為有效提取，更重要的為是人工合成服務(wù)。

我國有著豐富動(dòng)植物蛋白資源，而且食品加工產(chǎn)生下腳料也可作為其原料來源[7]。乳源性ACE抑制肽的應(yīng)用只是其中的一小部分，如何合理利用好現(xiàn)有的資源加工制備高活性ACE抑制肽將是今后的主要研究方向之一。ACE抑制肽的研究目前還處于起步階段，所以有著巨大的潛在市場和廣闊的發(fā)展前景。

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