乳酸菌對乳制品中黃曲霉毒素的生物防治作用

王曉偉，高鵬飛，姚國強(qiáng)，包維臣，李晶，劉喬，胡殿庚，張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心乳制品研究室，呼和浩特010018)

0 引言

霉菌引起的食品腐敗變質(zhì)及其產(chǎn)生的真菌毒素污染已經(jīng)成為危害人類健康的潛在因素。其中由黃曲霉及寄生曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素的性質(zhì)穩(wěn)定，一經(jīng)污染就很難去除，是極其棘手的食品安全問題[1]，然而，使用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法去除黃曲霉毒素具有一定的局限性，如導(dǎo)致食品營養(yǎng)價(jià)值、感官品質(zhì)的損失及相關(guān)昂貴的設(shè)備等，這些均導(dǎo)致亟待找尋去除效果顯著且安全無毒的去除方法[2]。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有優(yōu)良的表面特性，同時(shí)利用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行黃曲霉毒素生物去毒具有效率高、特異性強(qiáng)，及無二次污染等優(yōu)勢，故利用乳酸菌生物解毒成為去除黃曲霉毒素的新方向之一，是食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。此外，此方法不僅不破壞產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，并可提高產(chǎn)品利用率，同時(shí)能避免毒素的重新產(chǎn)生[3]。

1 黃曲霉毒素

1.1 黃曲霉毒素的簡介

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是由黃曲霉菌、寄生曲霉菌、特曲霉菌等多種真菌產(chǎn)生的一類具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物[4]。黃曲霉毒素目前已被分離鑒定出有20余種異構(gòu)體，其中最常見的異構(gòu)體包括B1，B2，G1，G2，M1，M2。黃曲霉只合成B1和B2兩種毒素，但大部分寄生曲霉能合成B1，B2，G1和G2，而M1和M2是動(dòng)物攝入B1后在體內(nèi)經(jīng)羥基化形成的代謝產(chǎn)物[5]。黃曲霉毒素不溶于水，但可溶于氯仿、甲醇和乙醇等有機(jī)溶劑，其在紫外線下具有熒光特性，其最適生長溫度為28～34℃，最適產(chǎn)毒溫度為24～30℃[6]。黃曲霉毒素在酸性和中性條件下較穩(wěn)定，但在堿性條件下易分解。黃曲霉毒素有較高的熱穩(wěn)定性，一般在268℃左右分解，所以普通烹調(diào)不能破壞黃曲霉毒素[7]。

1.2 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素于1993年被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為天然存在的強(qiáng)烈致癌物，其對魚類、禽類、家畜和靈長目類動(dòng)物的腫瘤誘導(dǎo)作用極強(qiáng)，并且能誘發(fā)癌癥。人食用黃曲霉毒素污染的食品后，會出現(xiàn)發(fā)熱、腹痛、嘔吐、食欲減退等癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)肝區(qū)疼痛、肝脾腫大、肝功能異常等肝病癥狀[8]。然而，黃曲霉毒素對人的致癌性缺乏直接證據(jù)，但大量的流行病學(xué)調(diào)查均證實(shí)，黃曲霉毒素的攝入量與人類肝癌的發(fā)病率呈正相關(guān)關(guān)系。工業(yè)上，黃曲霉毒素污染農(nóng)作物飼料、奶制品，動(dòng)物攝入污染了黃曲霉毒素的飼料可抑制幼小個(gè)體生長發(fā)育、降低動(dòng)物免疫力，并導(dǎo)致畜產(chǎn)品中黃曲霉毒素積累量及殘留量的增加，進(jìn)而危害人體健康。一次性大量攝入黃曲霉毒素可引起人和動(dòng)物急性中毒死亡，動(dòng)物半數(shù)致死量(LD50)為 0.36 mg/kg[9]。

2 乳酸菌生物防治作用

大量研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)物均可有效地降解黃曲霉毒素。其作用機(jī)制主要有兩種：抑制曲霉的生長代謝及其毒素的產(chǎn)生；吸附黃曲霉毒素[10]。

2.1 乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對曲霉生長及產(chǎn)毒的抑制作用

乳酸菌的抑菌作用主要通過兩種方式實(shí)現(xiàn)：菌種間的競爭性抑制；其生長過程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物的抑菌作用，如有機(jī)酸、脂肪酸、細(xì)菌素及抗真菌肽等。幾種乳酸菌對曲霉產(chǎn)毒能力的影響，見表1[11]。

表1 不同乳酸菌對曲霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素的影響

曲霉菌和乳酸菌共同培養(yǎng)或?qū)⑷樗峋拇x產(chǎn)物添加至曲霉菌的培養(yǎng)基中，都能抑制曲霉菌產(chǎn)生毒素。然而，早期的科研工作者[12]將乳桿菌裝在透析袋內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)果如下：曲霉菌能在袋外生長，但其產(chǎn)毒能力下降，這表明乳桿菌的某種代謝產(chǎn)物可能具有抑制曲霉菌產(chǎn)毒的功能.。Karunarame等[13]研究了嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌的菌體及其代謝產(chǎn)物分別對曲霉菌生長及產(chǎn)毒能力的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示：乳酸菌菌體可以抑制曲霉生長，但其代謝產(chǎn)物卻不能抑制曲霉菌體生長，而代謝產(chǎn)物可抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。

乳酸菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生乙酸、乳酸、丙酸、苯乳酸[14]等有機(jī)酸。有機(jī)酸可降低環(huán)境中的pH值，進(jìn)而抑制霉菌生長；此外，未解離的有機(jī)酸可破壞電化學(xué)質(zhì)子梯度，發(fā)揮其抑菌作用；而疏水形式的有機(jī)酸可透過目標(biāo)菌的細(xì)胞膜并且在細(xì)胞內(nèi)部解離，以致細(xì)胞質(zhì)酸化。如Lactobacillus delbrueckii NRRLB445在代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸可使寄生曲霉的產(chǎn)毒素量從8.5 mg/kg降低到7.0 mg/kg，輕度抑制其產(chǎn)毒能力。曹冬梅[15]等使用共培養(yǎng)法研究1株具有抑制霉菌活性的Lactobacillus curvatus HB02對黃曲霉生長及產(chǎn)毒的抑制作用，試驗(yàn)通過比色法和氣相色譜測定其培養(yǎng)物中的乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果為：Lactobacillus curvatus HB02與黃曲霉共培養(yǎng)時(shí)，黃曲霉菌絲和黃曲霉毒素B1的產(chǎn)量均比黃曲霉單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)低(P＜0.01)，試驗(yàn)結(jié)果表明該乳酸菌可以顯著抑制黃曲霉生長及黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生。同時(shí)，也可以推測得到乳酸菌對黃曲霉及其產(chǎn)毒的抑制作用可能是由乳酸導(dǎo)致的低pH值環(huán)境、各種代謝產(chǎn)物及微生物間相互拮抗等多因素協(xié)同作用所導(dǎo)致的結(jié)果。一般情況下，丙酸、戊酸與羥基脂肪酸可協(xié)同抑菌。Sjogren等研究發(fā)現(xiàn)羥基脂肪酸對多種霉菌均有抑制作用，其最低抑菌濃度為10～100 μg/mL[16]。

此外，乳酸菌代謝產(chǎn)生的具有抗真菌活性的的環(huán)二肽[17]、2-丙烯基酯[18]和蛋白質(zhì)類化合物[19]都可能會對黃曲霉及其產(chǎn)毒具有抑制作用，但相關(guān)的文獻(xiàn)較少?？傮w而言，目前關(guān)于乳酸菌對曲霉菌生長代謝及其產(chǎn)毒的具體抑制機(jī)理尚不清楚，值得廣大科研人員研究探明。

2.2 乳酸菌對黃曲霉毒素的吸附作用

乳酸菌菌體的吸附作用主要與菌體的濃度及溫度有關(guān)，而無論是活菌體或死菌體都具有較強(qiáng)的吸附能力。乳酸菌吸附黃曲霉毒素形成菌體—黃曲霉毒素復(fù)合體[20]，隨著乳酸菌自身吸附能力的下降，其較易與黃曲霉毒素一起排出體外，進(jìn)而降低毒素對人體的危害作用。李志剛[21]等研究探討了8株乳酸菌結(jié)合黃曲霉毒素B1的能力，結(jié)果表明，8株乳酸菌對黃曲霉毒素B1均有不同程度的吸附能力，但菌種間差異較大，其中L.casei subsp.cacei CGMCC 1.539的吸附強(qiáng)度為49%。此外，黃曲霉毒素B1—乳酸菌復(fù)合物可能也會阻礙黃曲霉毒素B1在人體內(nèi)的吸收，同時(shí)復(fù)合物比黃曲霉毒素B1更容易排出體外，進(jìn)而減少黃曲霉毒素B1在人體內(nèi)的累積量。Topcu等[22]研究發(fā)現(xiàn)兩株具有吸附黃曲霉毒素能力的乳酸菌(Enterococcus faecium M74和Enterococcus faecium EF031)，分別可吸附去除19.3%～30.5%和23.4%～37.5%的黃曲霉毒素(48h反應(yīng)時(shí)間內(nèi))。Khanafari[23]等運(yùn)用高效液相色譜法評估了Lactobacillus plantarum PTCC 1058在溶液中AFB1的結(jié)合率，接種1 h后結(jié)合率為45%，而接種90 h后結(jié)合率能夠達(dá)到100%，且處于對數(shù)生長期的Lactobacillus plantarum PTCC 1058在三次水洗情況下仍能保持92%的結(jié)合率，說明此黃曲霉毒素—乳酸菌復(fù)合物的穩(wěn)定性優(yōu)良。Hamidi等[24]分別從人體糞便和鮮奶中分離得到乳酸菌Lactobacillus pentosus和Lactobacillus beveris，使用ELISA法檢測溶液中AFB1的殘留量，置于37℃（48 h）后，Lactobacillus pentosus和Lactobacillus beveris對PBS溶液(AFB1初始質(zhì)量濃度為2 mg/L)中的AFB1結(jié)合率分別為17.4%和34.7%，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)這兩株乳酸菌均具有一定的毒素結(jié)合能力。Hernandez-Mendoza等[25]通過原子力顯微鏡和熒光技術(shù)研究了Lactobacillus reuteri NRRL14171結(jié)合黃曲霉毒素B1后其菌體細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)被修飾的變化，表現(xiàn)為邊緣的模糊化及紋理的不規(guī)則化，且變得粗糙。

乳酸菌菌體與黃曲霉毒素主要依靠細(xì)胞壁上的多聚糖和肽聚糖[26]等組分通過非共價(jià)方式結(jié)合[27]形成黃曲霉毒素—乳酸菌復(fù)合物,維持該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力是疏水相互作用。蛋白酶E、脂肪酶和m-高碘酸鹽對黃曲霉毒素吸附效果的影響與假設(shè)中黃曲霉毒素主要是與細(xì)菌細(xì)胞壁上的碳水化合物結(jié)合的推測較符合[28]。

Hernandez-Mendoza等篩選得到對黃曲霉毒素B1吸附率較高的Lactobacillus casei L30，其吸附率能夠達(dá)到49.2%；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)此吸附過程是一個(gè)有限制的可逆的過程，反復(fù)水洗僅能釋放0.6%～9.2%的毒素[29]。Hernandez-Mendoza等又[30]以 Lact.Reuteri和 Lact.casei Shirota為研究對象，以活菌組及細(xì)胞壁組為對照，試驗(yàn)結(jié)果為原生質(zhì)球組（Spheroplast，即肽聚糖缺陷組）的毒素吸附能力明顯下降，表明肽聚糖具有顯著去毒作用(P＜0.05)。此外，上述試驗(yàn)同時(shí)又設(shè)置了磷壁酸缺陷組，試驗(yàn)說明細(xì)胞壁在乳酸菌吸附黃曲霉毒素中具有重要作用，且其中的磷壁酸具有顯著去毒作用(P＜0.05)，磷壁酸缺乏組乳酸菌的吸附能力降低了70%左右。雖然已有研究顯示出乳酸菌細(xì)胞壁中的磷壁酸在吸附黃曲霉毒素中有一定的作用效果，但是，其具體的吸附機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的研究探明。

3 乳酸菌對乳制品中黃曲霉毒素生物防治作用的應(yīng)用

乳酸菌具有抑制曲霉生長及產(chǎn)毒的作用，常常作為生物去毒劑用于食品中，常見的菌種有Lactobacillus spp.，Lactococcus spp.，Leuconostoc spp.，Pediococcus spp.，Streptocccus spp和Enterococcus spp.[31]。

黃曲霉毒素Ml和M2常見于牛奶污染。Rahimi[32]等人利益ELISA方法對不同原奶樣品進(jìn)行黃曲霉毒素Ml檢測，結(jié)果42.1%的樣品中檢測出了Ml。El Khoury[33]等人檢測了138種乳制品(牛奶和酸奶)中黃曲霉毒素Ml的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，32.81%的酸奶樣品和40.62%的牛奶樣品中可檢測出黃曲霉素M1。據(jù)悉，質(zhì)檢機(jī)構(gòu)已將黃曲霉毒素M1質(zhì)量濃度設(shè)為液體乳長效監(jiān)測指標(biāo)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)M1超標(biāo)，應(yīng)立即依法處置，力求保障液體乳的質(zhì)量安全。

乳酸菌被廣泛地應(yīng)用在發(fā)酵食品中，具有改善腸道微生態(tài)平衡，生物防腐及生物去毒作用等優(yōu)勢。黎巴嫩的傳統(tǒng)工業(yè)中常使用Lcictobaciuiis biilgaricus和Streptococcus thermophilic作為生產(chǎn)菌株，被用于評估其降低黃曲霉毒素M1質(zhì)量濃度的能力[33]。牛奶中常用的生物去毒乳酸菌菌種有Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495、Lactobacillus reuteri NRRL B-14171、Lactobacillus rhamnosus NRRL B-442、Lactobacillus johnsonii NRRL B-2178、Bifidobacterium bifidum NRRL B-41410[34]。乳酸菌L.plantarum MON03和L.rhamnosus GAF01(108cfu/mL)在復(fù)原乳(reconstituted milk)中的AFM1結(jié)合率分別為16.1%～78.6%和15.3%～95.1%[35]。三株不同乳酸菌Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus LB340，Lactobacillus rhamnosus HOWARU ，Bifidobacterium lactis FLORA-FIT BI07置于37℃（15 min）后，其在含有AFM1為0.5 μg/L的UHT脫脂牛奶中的毒素結(jié)合率無 顯 著 差 別 (P＜0.05)，而 Bifidobacterium lactis FLORA-FIT BI07置于4℃（15 min）表現(xiàn)出較高的結(jié)合率37.75%±3.31%[36]。

Elsanhoty[37]等進(jìn)行了乳酸菌去除酸奶中黃曲霉毒素M1的研究。試驗(yàn)分為三組：A組(對照組)，發(fā)酵酸奶 (Streptococcus thermophilus和 Lactobacillus bulgaricus)；B組，50%發(fā)酵酸奶(Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus)與50%Lactobacillus plantrium；C組，50%發(fā)酵酸奶(Streptococcus thermophilus和 Lactobacillus bulgaricus)與50%Lactobacillus acidophilus；并于5 ℃分別貯藏1，3，5，7 d，利用高效液相色譜法定時(shí)測定其中黃曲霉毒素M1的去除率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A組、B組和C組在貯藏期結(jié)束時(shí)的去除率分別為22.8%～69.8%、31.5%～87.8%、27.8%～72.8%，其中B組具有最大的毒素去除率，且最終黃曲霉毒素 M1 的質(zhì)量濃度分別為 15.2，11.3，13.56 μg/L(原奶中的黃曲霉毒素M1質(zhì)量濃度為50 μg/L)，達(dá)到酸奶的AFM1安全水平。結(jié)果表明：乳酸菌能夠作為安全有效的生物去除劑用在污染了黃曲霉毒素M1的酸奶中。Corassin[38]等將經(jīng)100℃處理1 h的混合乳酸 菌 (Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus和Bifidobacterium lactis)以1010cfu·mL的接種量加入含有AFM1為0.5 ng/mL的UHT脫脂牛奶中，置于37℃（30 min及60 min）后，AFM1的平均吸附率分別為11.5%±2.3%和11.7%±4.4%。綜上所述，乳酸菌可用于乳制品中黃曲霉毒素的生物防治。

4 安全性評價(jià)

在安全性上，乳酸菌是傳統(tǒng)的發(fā)酵菌株，且是公認(rèn)的安全級(Generally Recognized as Safe，GRAS)菌株。相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)也均證明乳酸菌對黃曲霉毒素的毒害具有降低作用[39-43]。

Hernandez-Mendoza等[44]將15只雄性Wistar大鼠(200 g±20 g)暴露在黃曲霉毒素環(huán)境中3周以建立中毒大鼠模型，而后將其平均分成三組：A組，對照組；B組，黃曲霉毒素試驗(yàn)組；C組，黃曲霉毒素+Lactobacillus casei Shirota試驗(yàn)組，依據(jù)測定血漿中AFB1-Lys絡(luò)合物的含量來評估菌株Lactobacillus casei Shirota對腸道中毒素的吸收作用。C組與B組相比較，前者血漿中的AFB1-Lys絡(luò)合物濃度顯著低于后者。本研究證明了Lactobacillus casei Shirota可以顯著降低黃曲霉毒素在動(dòng)物腸道中的吸收作用。因此，使用乳酸菌生物防治乳制品的黃曲霉毒素污染具有可行性及現(xiàn)實(shí)意義，更大程度地保障了人體的健康。

5 展望

曲霉及其毒素污染乳制品是一個(gè)普遍性問題，這種污染可發(fā)生在乳制品的產(chǎn)前、產(chǎn)中或儲藏過程中，既導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,又嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康。為此，世界各國對乳制品中越來越多的黃曲霉毒素進(jìn)行了嚴(yán)格的限量規(guī)定，因此有效地防治毒素污染已成為重要的研究課題。

利用安全的乳酸菌菌種資源進(jìn)行毒素的生物防治已經(jīng)成為爭相研究的熱點(diǎn)，但仍有以下幾方面的工作需給予加強(qiáng)：一是加強(qiáng)黃曲霉毒素污染的生物防治研究，提高相關(guān)的科研水平，從根本上保障我國乳制品的的食品安全性；二是加強(qiáng)具有特異性抑制毒素合成的微生物資源的分離和篩選，進(jìn)而為研發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型微生物制劑提供豐富的菌種資源。隨著科研工作的深入開展，生防微生物及其天然活性代謝產(chǎn)物必將成為乳制品生產(chǎn)和儲藏中替代化學(xué)試劑有效防治黃曲霉毒素污染的最具希望的方法之一。

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