熱處理對牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白及無機(jī)鹽的影響

李啟明，馬鶯，李琳，何勝華

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090）

0 引言

熱處理在乳的加工過程中起著很重要的作用，不僅能提高乳的加工特性，還能延長貨架期[1]。酪蛋白膠束是由酪蛋白和磷酸鹽連接的一種復(fù)合物[2]。然而，在一定溫度條件下，酪蛋白從酪蛋白膠束上解聚下來進(jìn)入乳清中，同時(shí)導(dǎo)致酪膠束中無機(jī)鹽的變化，影響酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。

酪蛋白的解聚與乳的pH值和溫度有關(guān)，酪蛋白解聚的量隨著pH值和溫度的升高而增加[3]。目前利用RP-HPLC分析熱處理牦牛乳酪蛋白膠束上蛋白的解聚及濕法消解法/電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定無機(jī)鹽的變化較少，本文采用RP-HPLC分析熱處理牦牛乳酪蛋白膠束上蛋白的解聚及濕法消解法/電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定無機(jī)鹽的變化，探討牦牛乳在熱處理過程中酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料是采集于四川省紅原縣的牦牛乳樣品，采集的樣品加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的疊氮化鈉并在-18℃冷凍，并迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行牦牛乳熱穩(wěn)定性的研究。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀；全譜直讀電感耦合等離子器（Perkin-Elmer，美國）；離子色譜儀（ICS-3000，Dionex）。

2 方法

2.1 牦牛乳的熱處理

取10 mL牦牛乳于25 mL具塞試管中，于油浴鍋在120℃加熱10 min或140℃加熱2 min，邊加熱邊振蕩，加熱完成后，冷卻至室溫。

2.2 膜過濾

將熱處理和未熱處理的牦牛乳經(jīng)過分子量30 ku的膜過濾，膜被固定在一個(gè)平板和框架系統(tǒng)里(Consep 3000系列)，利用高壓泵來提供循環(huán)的操作壓力，酪蛋白膠束被截留，乳清及乳清蛋白透過濾膜成為濾液。

2.3 乳蛋白分析

牦牛乳蛋白分析參考Li等人的方法[4]。選用Sigma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。50 mgκ-酪蛋白 (純度 ＞80%)，125 mgαs-酪蛋白 (純度＞85%)，50 mgβ-酪蛋白 (純度＞ 90%)。牦牛乳樣品用流水解凍，于4℃下3 000×g離心10 min，去除脂肪。取1 mL牦牛脫脂乳分散到4 mL緩沖液中（濃度為8 mol/L尿素，165 mmol/L Tris，44 mmol/L檸檬酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為0.3%的二巰基乙醇）。

RP-HPLC系統(tǒng)：Agilent 1100。柱類型及規(guī)格：Jupiter C4 column(250 mm×4.6 mm,300A-sized pores，5-μm sized particles)。檢測波長為 220 nm，溫度為30℃，進(jìn)樣量為20μL，洗脫液流速為0.8 mL/min。洗脫液：A和B兩種洗脫液，A為色譜純的水（加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸），B為色譜純的乙腈（加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸）。洗脫條件為：上樣前先用A液平衡，上樣后0～40 min B液濃度從30%升到50%；40～42 min B液濃度從50%升到100%；42～43 min B液濃度為100%；43～46 min B液濃度從100%降到30%，然后再用起始洗脫液洗脫5 min?？傁疵摃r(shí)間為51 min。分離牦牛脫脂乳中的αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La，β-Lg（A和B）。

2.4 鈣、鎂和磷元素的分析

牦牛乳中鈣、鎂和磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析按照Bocca等人的方法[5]。

2.4.1 濕法硝解

取待硝解樣品4.00 g于150 mL三角瓶中，加10 mL HNO3，于電熱板上徐徐加熱至濃煙冒盡后，滴加H2O2至溶液無色或微淡黃色，定容至10 mL，搖勻，靜止待測。（若硝解不徹底，可加少量高氯酸，若濃度太大，可稀釋10倍再測）

2.4.2 樣品中各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

硝解好的樣品經(jīng)美國Perkin-Elmer Optima 5 300 PV全譜直讀電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定樣品中各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

儀器工作條件：RF功率1.3 kW，等離子氣流量15 L/min，輔助氣流量0.2 L/min，霧化氣流量0.8 L/min，蠕動(dòng)泵流速1.5 mL/min，樣品沖洗時(shí)間60 s，積分時(shí)間5 s，觀測方向?yàn)檩S向。

2.5 磷酸鹽和檸檬酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.5.1 離子色譜前處理

用HCL將牦牛乳原樣的pH值調(diào)至4.6，用離心機(jī)于4 000 r/min離心20 min，取上清液3 mL，用有機(jī)系0.45 um濾膜過濾，濾出液用超純水稀釋10倍，稀釋后的樣品過Diomex OnGuard RP柱除去樣品中的脂肪，去脂肪后的樣品待測。

取未熱處理樣品透過液、經(jīng)120℃熱處理的樣品透過液、經(jīng)140℃熱處理的樣品透過液各5 g（5 mL），在冰箱中4℃沉降10 min，取上清液3 mL，用有機(jī)系0.45 um濾膜過濾，用超純水稀釋10倍，稀釋后的樣品過Diomex OnGuard RP柱除去樣品中的脂肪，去除脂肪的樣品待測。

2.5.2 樣品中檸檬酸和磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

將前處理好的4個(gè)樣品用離子色譜儀（ICS-3000，Dionex）進(jìn)行檢測，測定樣品中檸檬酸和磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)。檢測儀器工作條件：

（1）流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為100 ug，離子液為KOH，柱子為IONPAC AS11-HC，溫度為25℃。

（2）洗涮條件：0 min為 20 mmol；15 min為 30 mmol；25 min為20 mmol；30 min為20 mmol。

（3）計(jì)算公式：標(biāo)樣質(zhì)量濃度（10 mg/L）/標(biāo)樣峰面積=樣品濃度/樣品峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化

牦牛乳分別經(jīng)過140℃加熱2 min（120℃）加熱10 min和未加熱3種不同處理方式，將熱處理和未熱處理的脫脂乳用分子量為3×104u的膜超濾，利用RP-HPLC分析截留液中各蛋白組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分析不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束的解聚和乳清蛋白的變性作用。

圖1為不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化，在未熱處理時(shí)，牦牛乳中κ-CN的質(zhì)量濃度為6.42 g/L，而分別經(jīng)過140℃（2 min）和120℃（10 min）進(jìn)行熱處理后，牦牛乳中κ-CN的質(zhì)量濃度分別為4.02 g/L和4.55 g/L，熱處理后的牦牛乳酪蛋白膠束中κ-CN的質(zhì)量濃度明顯低于（P＜0.05)未熱處理牦牛乳中κ-CN質(zhì)量濃度，說明有部分κ-CN在熱處理情況下從酪蛋白膠束上解聚下來進(jìn)入乳清中，κ-CN從酪蛋白解聚后與熱變性的乳清蛋白通過二硫鍵形成可溶性κ-CN/乳清蛋白復(fù)合物[6]。未加熱牦牛乳中αs2-CN的質(zhì)量濃度為3.78 g/L，而分別經(jīng)過140℃（2 min）和120℃（10 min）進(jìn)行熱處理后，牦牛乳中αs2-CN的質(zhì)量濃度分別為1.93 g/L和2.57 g/L，熱處理后的牦牛乳酪蛋白膠束中αs2-CN的質(zhì)量濃度明顯低于（P＜0.05)未熱處理牦牛乳中αs2-CN質(zhì)量濃度，說明有部分αs2-CN在熱處理情況下也從酪蛋白膠束上解聚下來進(jìn)入乳清中。另外αs1-CN和β-CN也出現(xiàn)類似的情況。

圖1 不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束中酪蛋白的變化

3.2 不同熱處理牦牛乳無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

牦牛乳分別在140℃（2 min）和120℃（10 min）進(jìn)行熱處理，分別將熱處理和未熱處理的脫脂乳用分子量為3×104u的膜超濾。表1為采用濕法消解法/電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定不同熱處理牦牛乳中Ca、Mg和P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。熱處理牦牛乳超濾液中的Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未加熱牦牛乳中Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)要低，這主要是在熱處理過程中一些游離Ca參與了乳清蛋白與酪蛋白膠束的熱誘導(dǎo)聚合作用，導(dǎo)致超濾液中Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

P也是與酪蛋白結(jié)合在一起，未加熱牦牛乳超濾液中P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比加熱牦牛乳中P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高，可溶性P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，牦牛乳也越穩(wěn)定，牦牛乳經(jīng)熱處理后，可溶性P在受熱情況下與酪蛋白發(fā)生了結(jié)合，從而降低了可溶性P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)導(dǎo)致牦牛乳在加熱情況下變得不穩(wěn)定。未加熱牦牛乳可溶性Ca/P比為0.74，而分別經(jīng)140℃（2 min）和120℃（10 min）熱處理的牦牛乳的Ca/P比為1.08和1.07，因此Ca/P比較低的乳熱穩(wěn)定性高。

表1 Ca，Mg和P在不同熱處理牦牛乳中的分配 mg/kg

3.3 不同熱處理牦牛乳磷酸鹽及檸檬酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

磷酸鹽和檸檬酸鹽也是酪蛋白膠束穩(wěn)定性的重要組成成分，牦牛乳中無機(jī)鹽采用ICS-3000離子色譜測定。乳中磷酸鹽和檸檬酸鹽與Ca和Mg結(jié)合在一起。乳中可溶性檸檬酸鈣和檸檬酸鎂比磷酸鈣和磷酸鎂結(jié)合的強(qiáng)度高，因此在pH值恒定或變化不大時(shí)，可溶性Ca和Mg與檸檬酸直接相關(guān)。表2為磷酸鹽和檸檬酸鹽在不同熱處理牦牛乳中的分配。由表1可以看出，未加熱牦牛乳中檸檬酸鹽比加熱牦牛乳中檸檬酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高，而加熱牦牛乳酪蛋白膠束中的磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未加熱要高，這可能是在加熱情況下，游離的Ca與磷酸鹽一起與酪蛋白發(fā)生了結(jié)合。

表2 磷酸鹽和檸檬酸鹽在不同熱處理牦牛乳中的分配 mg/kg

4 結(jié)論

(1)利用RP-HPLC分析了不同溫度下牦牛乳酪蛋白膠束蛋白的變化，經(jīng)過140℃（2 min）和120℃（10 min）進(jìn)行熱處理后，牦牛乳酪蛋白膠束中κ-CN，αs2-CN，αs1-CN和β-CN發(fā)生了不同程度的解聚。

(2)采用濕法消解法/電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定不同熱處理牦牛乳中Ca、Mg和P的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。熱處理牦牛乳超濾液中的Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未加熱牦牛乳中Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高，可溶性鈣高，則表現(xiàn)出牦牛乳由于受熱作用開始不穩(wěn)定。

（3）牦牛乳中無機(jī)鹽采用ICS-3000離子色譜測定，加熱牦牛乳酪蛋白膠束中的磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未加熱要高，這可能是在加熱情況下，游離的Ca與磷酸鹽一起與酪蛋白發(fā)生了結(jié)合。

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