黑龍江省生乳中β-內(nèi)酰胺酶的監(jiān)測(cè)與結(jié)果分析

楊光，邢宇，趙平，陳麗，丁松喬

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，哈爾濱150028）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，乳制品的安全問(wèn)題備受關(guān)注。由于利益驅(qū)動(dòng)，一些不法商家，向生乳中添加“抗生素分解劑”來(lái)掩蓋抗生素的存在。經(jīng)證實(shí)，這種分解劑為“β-內(nèi)酰胺酶”[1]。

β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因，因此，過(guò)多攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良后果[2]。衛(wèi)生部于2009年3月相繼發(fā)布了關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治近期工作重點(diǎn)及要求》的通知（衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2009]21號(hào)）和關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知（食品整治辦[2009]29號(hào)），明確指出“添加β-內(nèi)酰胺酶（等）非食品用物質(zhì)屬違法行為”[3,4]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品來(lái)源

本研究共采集了400份生乳樣品。樣品采集地點(diǎn)分別為黑龍江省內(nèi)的奶站、運(yùn)輸車、生產(chǎn)企業(yè)收奶間及奶倉(cāng)等。根據(jù)生乳不易保存的特點(diǎn)，為確保監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確性，必須在最短的時(shí)間內(nèi)完成樣品的檢測(cè)工作；樣品采集后立即放入0～4℃冷藏箱中保存，并于當(dāng)天送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

檢測(cè)采用食品整治辦[2009]29號(hào)指定檢驗(yàn)方法4《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)檢驗(yàn)方法-杯碟法》進(jìn)行[5]。

1.2.1 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

抑菌圈測(cè)量?jī)x；恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃）；高壓蒸汽滅菌器；無(wú)菌培養(yǎng)皿（內(nèi)徑90 mm，底部平整光滑的玻璃皿）；無(wú)菌牛津杯（外徑8.0 mm±0.1 mm，內(nèi)徑6.0 mm±0.1 mm，高度10.0 mm±0.1mm）。

標(biāo)準(zhǔn)比濁管；恒溫水浴；無(wú)菌吸管：1 mL（0.01 mL刻度值），10 mL（0.1mL刻度值）；加樣器（5～20 μL，20～200 μL及配套吸頭）；全自動(dòng)牛津杯放置器；陶瓦蓋。

1.2.2 培養(yǎng)基和試劑

所用試劑均為分析純，水為GB/T6682中規(guī)定的三級(jí)水。

實(shí)驗(yàn)菌種：藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，傳代次數(shù)不得超過(guò)14次。

磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）；生理鹽水（8.5 g/L）；青霉素鉀鹽（D.R）標(biāo)準(zhǔn)溶液；β-內(nèi)酰胺酶（Sigema）標(biāo)準(zhǔn)溶液；舒巴坦（D.R）標(biāo)準(zhǔn)溶液；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ。

1.3 操作步驟

1.3.1 菌懸液的制備

將藤黃微球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測(cè)定菌懸液濃度，終濃度為1×1010mL-1，4℃保存，貯存期限2周。

1.3.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標(biāo)為：A、B、C、D，每個(gè)樣品做三個(gè)平行，共12管，同時(shí)每次檢驗(yàn)應(yīng)取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對(duì)照。

1.3.3 檢驗(yàn)用平板的制備

取90 mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108mL-1藤黃微球菌的抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，凝固后備用。

1.3.4 樣品的測(cè)定

按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品及純水中：

A ：青霉素5 μL。

B ：舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

C ：β-內(nèi)酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。

D ：β-內(nèi)酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。

混勻后，將上述A～D試樣各200 μL加入放置于檢驗(yàn)用平板上的4個(gè)無(wú)菌牛津杯中，（36±1）℃培養(yǎng)培養(yǎng)18～22 h，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)樣品，取三次平行試驗(yàn)平均值。

1.3.5 結(jié)果報(bào)告

純水樣品結(jié)果應(yīng)為：（A）、（B）、（D）均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈；（A）的抑菌圈與（B）的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(nèi)(含3 mm)，且重復(fù)性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復(fù)性良好。如為此結(jié)果，則系統(tǒng)成立，可對(duì)樣品結(jié)果進(jìn)行如下判定。

（1）如果樣品結(jié)果中（B）和、（D）均產(chǎn)生抑菌圈，且（C）與（D）抑菌圈差異在3 mm以上（含3 mm）時(shí)，可按下述（2）（3）判定結(jié)果。

（2）（A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣添加有β-內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

（3）（A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差異小于3 mm，且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣未添加有β-內(nèi)酰胺酶，報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陰性。

（4）如果（A）和（B）均不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

（1）本研究共監(jiān)測(cè)生乳樣品400批次，其中392批次檢驗(yàn)結(jié)果為β-內(nèi)酰胺酶陰性，8批次檢驗(yàn)結(jié)果為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，分布在5家企業(yè)。樣品陽(yáng)性率2%。8批次陽(yáng)性樣品分別在三次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

（2）本研究采集的400批次樣品，β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性僅為8批次，陽(yáng)性率為2%（見(jiàn)圖1）。其原因主要是各級(jí)有關(guān)政府部門近年來(lái)加大了對(duì)使用非法添加物等行為的打擊力度，并且企業(yè)也增加了對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)頻次。即便如此，仍有8批次的生乳樣品β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。這說(shuō)明個(gè)別奶農(nóng)仍因利益驅(qū)動(dòng)，向含有抗生素的生乳中而非法加入β-內(nèi)酰胺酶，以降解抗生素。

表1 β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) mm

圖1 生乳中β-內(nèi)酰胺酶監(jiān)測(cè)結(jié)果

本次乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的樣品采集涵蓋了生產(chǎn)與流通兩大領(lǐng)域。根據(jù)不同產(chǎn)品的特點(diǎn)，采樣地點(diǎn)分別在奶站、運(yùn)輸車、生產(chǎn)企業(yè)收奶間及奶倉(cāng)，表2體現(xiàn)了不同采樣環(huán)節(jié)的樣品情況。

表2 不同采樣環(huán)節(jié)乳及乳制品β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果

監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：在奶站采集的207批次產(chǎn)品，3批次呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率1.4%；運(yùn)輸車抽檢180批次，5批次呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率2.8%。說(shuō)明最易出現(xiàn)問(wèn)題的兩個(gè)環(huán)節(jié)為奶站與運(yùn)輸車，不排除在這兩個(gè)環(huán)節(jié)非法添加β-內(nèi)酰胺酶的可能性。

2.3 原因分析

近十幾年來(lái)，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，養(yǎng)殖模式向著集約化、現(xiàn)代化大型牧場(chǎng)發(fā)展。特別是2014年起國(guó)家要求嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)須建自有牧場(chǎng)更加速了這一進(jìn)程。但根據(jù)我國(guó)國(guó)情，目前仍以分散養(yǎng)殖為主。由于分散養(yǎng)殖飼養(yǎng)條件差、技術(shù)落后等因素致使奶牛乳房炎等疾病發(fā)病率仍居高不下，導(dǎo)致奶農(nóng)盲目大量使用抗生素。特別是β-內(nèi)酰胺類抗生素由于價(jià)格低、效果好、容易獲得等原因而普遍使用。這對(duì)于泌乳期的奶牛而言，所生產(chǎn)的牛奶中就會(huì)含有一定量的抗生素殘留。個(gè)別奶農(nóng)為減小損失仍將含有抗生素殘留的牛奶送交企業(yè)，就需在奶中加入β-內(nèi)酰胺酶以降解抗生素。自2009年3月原衛(wèi)生部將其列為非法添加物以來(lái)，隨著相關(guān)部門監(jiān)管力度加大與企業(yè)在收購(gòu)時(shí)的檢測(cè)，非法添加β-內(nèi)酰胺酶現(xiàn)象逐年下降，由原來(lái)的普遍添加到目前極個(gè)別奶農(nóng)的非法添加。即便如此，仍時(shí)有發(fā)生，不能從根本上加以拒絕。根據(jù)對(duì)不同環(huán)節(jié)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果看，不合格樣品全部來(lái)自于奶站與運(yùn)輸車，所以在這兩個(gè)環(huán)節(jié)添加β-內(nèi)酰胺酶可能性極大。由于此種非法添加只有在奶牛使用抗生素后才使用，就黑龍江而言，8～10月份屬于奶牛疾病低發(fā)階段，這也是檢出β-內(nèi)酰胺酶較低的原因之一。為確保安全，必須加強(qiáng)對(duì)整個(gè)乳業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈的監(jiān)管。

3 結(jié)束語(yǔ)

基于本次乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶專項(xiàng)監(jiān)測(cè)結(jié)果，雖然生乳中非法添加β-內(nèi)酰胺酶為個(gè)別現(xiàn)象，但仍然存在個(gè)別奶農(nóng)的違規(guī)現(xiàn)象。由于黑龍江省奶牛養(yǎng)殖模式仍以分散養(yǎng)殖為主，乳腺炎等疾病發(fā)病率高，抗生素使用不規(guī)范等特點(diǎn)，短期內(nèi)牛奶中抗生素殘留的問(wèn)題仍會(huì)普遍存在。而奶農(nóng)為減小損失會(huì)設(shè)法將含有抗生素的牛乳通過(guò)加入β-內(nèi)酰胺酶等方式以掩蓋抗生素殘留送交到乳品企業(yè)。所以其危害性仍不容忽視，為此建議相關(guān)部門：

一是加大監(jiān)測(cè)頻次，特別是在最可能非法添加β-內(nèi)酰胺酶的奶牛疾病高發(fā)期進(jìn)行監(jiān)測(cè)；

二是加大監(jiān)管力度，使專項(xiàng)監(jiān)測(cè)形成常態(tài)化，建議在全國(guó)范圍內(nèi)開展乳和乳制品β-內(nèi)酰胺酶風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作，據(jù)此可及時(shí)發(fā)現(xiàn)非法添加β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生的重點(diǎn)地區(qū)與時(shí)間，為政府監(jiān)管提供可靠的依據(jù)，同時(shí)也可震懾不法分子的非法添加等行為。

[1]崔生輝，李景云，馬越.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測(cè)[J].中國(guó)衛(wèi)生食品雜志，2007,19（2）113-116.

[2]沈浥，劉洋，李兆階.乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的研究進(jìn)展和標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2014，288，（11）：35-38.

[3]衛(wèi)生部.關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治近期工作重點(diǎn)及要求》的通知（衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2009]21號(hào)）.

[4]衛(wèi)生部.關(guān)于印發(fā)《全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案》的通知（食品整治辦[2009]29號(hào)）.

[5]食品整治辦[2009]29號(hào)指定檢驗(yàn)方法4.乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法（杯碟法）.