脂聯(lián)素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中的變化作用及分子機(jī)制

鄧應(yīng)忠， 曹晨， 鄭興萍， 薛銳， 劉芳， 胡鄂曼， 譚啟榮

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

脂聯(lián)素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中的變化作用及分子機(jī)制

鄧應(yīng)忠， 曹晨， 鄭興萍， 薛銳， 劉芳， 胡鄂曼， 譚啟榮

目的： 通過建立大鼠糖尿病心肌缺血再灌注模型及缺血后處理模型，探討脂聯(lián)素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷及缺血后處理中的變化及分子機(jī)制。

方法： 雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為6組：正常假手術(shù)組（n=8）、正常心肌缺血再灌注組（n=16）、正常缺血后處理組（n=16）、糖尿病假手術(shù)組（n=8）、糖尿病心肌缺血再灌注組（n=16）和糖尿病缺血后處理組（n=16）。腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病模型， 缺血再灌注模型采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min再灌注120 min的方法建立； 缺血后處理于再灌注前給予3個(gè)循環(huán)再灌注10 s，缺血10 s的處理；假手術(shù)模型僅以絲線穿過冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎。再灌注120 min后處死大鼠，取心肌組織，三苯基氯化四氮唑法（TTC法）測(cè)定梗死面積；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血漿中脂聯(lián)素的含量。免疫印跡方法（Western blot方法）測(cè)定心肌組織磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和總蛋白激酶B（Total-Akt）表達(dá)。

結(jié)果： 與正常心肌缺血再灌注組比較，正常缺血后處理組心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.05），而糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組的心肌梗死面積顯著增加（P＜0.01）；與正常假手術(shù)組比較，正常心肌缺血再灌注組和正常缺血后處理組血清脂聯(lián)素和p-Akt蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），糖尿病假手術(shù)組p-Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與正常缺血后處理組比較，糖尿病假手術(shù)組、糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組脂聯(lián)素和p-Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線性相關(guān)分析顯示，血漿脂聯(lián)素的表達(dá)水平與心肌梗死面積呈負(fù)相關(guān)，而與心肌組織中p-Akt表達(dá)水平呈正相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)分別為0.63和0.65（P＜0. 01）。

結(jié)論：糖尿病血清脂聯(lián)素表達(dá)降低，可致磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路失活，導(dǎo)致糖尿病缺血再灌注損傷加重，缺血后處理不能實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病心肌的保護(hù)作用。

脂聯(lián)素；糖尿病；缺血再灌注損傷；缺血后處理；心肌保護(hù)

Methods: A total of 80 male SD rats were randomly divided into 6 groups: Normal sham (NS) group, n=8, Normal ischemiareperfusion injury (NIRI) group, n=16, Normal ischemia post-conditioning (NIPO) group, n=16 and Diabetic mellitus sham (DMS) group, n=8, Diabetic mellitus ischemia-reperfusion injury (DMIRI) group, n=16, Diabetic mellitus ischemic post-conditioning (DMIPO) group, n=16. DM rats model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin; IR model was established by occlusion of left anterior descending (LAD) coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 120min; IPO model was established by 3 cycles of ischemia for 10s and reperfusion for10s; the rats in Sham group received silk line wrapping of LAD without occlusion. The myocardial infarction (MI) area was measured by TTC staining, plasma adiponectin level was examined by ELISA,

the protein expressions of p-Akt and total-Akt were detected by Western blot analysis.

Results: Compared with NIRI group, NIPO group had decreased MI area, P＜0.05, while DMIRI group and DMIPO group had increased MI area, P＜0.01; compared with NS group, NIRI group and NIPO group showed up-regulated expression of adiponectin and p-Akt, P＜0.05 and DMS group showed down-regulated p-Akt, P＜0.05. Compared with NIPO group, three DM groups presented down-regulated adiponectin and p-Akt, P＜0.05. Linear correlation analysis indicated that plasma adiponectin expression level was negatively related to MI area and positively related to myocardial tissue p-Akt expression with the correlation coefficient at 0.63 and 0.65 respectively, P＜0.01.

Conclusion: Down-regulated plasma adiponectin expression may cause the inactivation of PI3K/Akt signal pathway and therefore aggravate DM ischemia-reperfusion injury which cannot be protected by ischemic post-conditioning in experimental rats. Key words Adiponectin; Diabetes mellitus; Ischemia-reperfusion injury; Ischemic post-conditioning; Myocardial protection

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:879.)

近年研究表明中國(guó)糖尿病總體發(fā)病率約為11.6%，前驅(qū)糖尿病發(fā)病率為50.1%[1]，缺血性心臟病是糖尿病患者主要的心血管并發(fā)癥和首要致死原因[2]。糖尿病患者易患急性心肌梗死，表現(xiàn)為心肌梗死面積大、心臟衰竭重，病情重進(jìn)展快、死亡率高[3]，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張術(shù)或介入治療后效果較差，再次手術(shù)幾率高[4]，實(shí)施包括冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等圍術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生率高、預(yù)后差[2，5]。缺血后處理可持續(xù)緩解心肌缺血再灌注損傷，有效減小心肌梗死面積，不僅對(duì)動(dòng)物心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，對(duì)人類心臟也有保護(hù)作用[6]，缺血后處理這一研究結(jié)論僅限于成人和動(dòng)物模型，而對(duì)糖尿病心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用減弱或消失，其機(jī)制尚未完全闡明。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)代謝、血管與心臟保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。研究表明脂聯(lián)素基因敲除小鼠對(duì)心肌缺血再灌注損傷程度顯著增加，2型糖尿病患者血漿中脂聯(lián)素水平明顯降低，并且與缺血性心臟病呈負(fù)相關(guān)，提示脂聯(lián)素與糖尿病患者缺血性心臟病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探討糖尿病心肌缺血再灌注損傷、缺血后處理過程中脂聯(lián)素的變化作用及可能信號(hào)機(jī)制。

1 材料和方法

試劑: 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[7]測(cè)定脂聯(lián)素（試劑盒：上海美季生物有限公司），細(xì)胞裂解液（RIPA）（碧云天公司），苯甲基磺酰氟（PMSF）（科瑞生物），Cocktail蛋白酶抑制劑（美國(guó)羅氏公司），甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED（美國(guó)Sigma公司），過硫氨酸（AP）、Tris-base（國(guó)藥集團(tuán)），蛋白激酶B（Akt）單克隆抗體（兔抗大鼠）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）單克隆抗體（兔抗大鼠）（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），羊抗兔單克隆熒光二抗（美國(guó)LI-COR公司），BCA法蛋白定量試劑盒（碧云天公司）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:2013-06至2014-03，采用健康成年雄性SD大鼠，體重220～250g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。野生型成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常假手術(shù)組（n=8）、正常心肌缺血再灌注組（n=16）、正常缺血后處理組（n=16）、糖尿病假手術(shù)組（n=8）、糖尿病心肌缺血再灌注組（n=16）和糖尿病缺血后處理組（n=16）。

動(dòng)物模型的建立：（1）大鼠糖尿病模型的建立：將80 只健康雄性SD 大鼠，先喂以高脂高果糖飼料4 W，其中40只大鼠按照體重，以30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）1次，2 W后誘導(dǎo)建立2型糖尿病模型[8]。其余40只大鼠，按照體重腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液。注射后繼續(xù)自由進(jìn)食飲水，同時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的飲食量、飲水量和尿量。72 h后當(dāng)血糖濃度＞16.7 mmol/L并持續(xù)1 W以上時(shí)表示糖尿病鼠模型誘導(dǎo)成功。所有實(shí)驗(yàn)在成模8 W后開始，實(shí)驗(yàn)期間每周監(jiān)測(cè)血糖水平、胰島素水平一次。（2）糖尿病心肌缺血再灌注損傷及缺血后處理模型的建立：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉并固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。在大鼠四肢皮下及胸前插入針性電極，連接小動(dòng)物心電圖儀。缺血再灌注模型建立如下：左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包膜，充分暴露心臟。在左心耳的下緣處可以觀察到一白線狀血管，即為冠狀動(dòng)脈左前降支,其剛好位于肺動(dòng)脈圓錐下緣約2 mm處,用6～0帶線手術(shù)針進(jìn)行穿線結(jié)扎，見心尖部位以及左心室前壁變白，心電圖可見ST 段即刻抬高, T波變高，提示結(jié)扎部位正確。結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線恢復(fù)血流，可

觀察到左心室恢復(fù)紅潤(rùn)，ST段回落。解除移液槍頭的套疊狀態(tài)即可恢復(fù)血供進(jìn)行再灌注，再灌注的初期，從心電圖上可觀察到明顯的再灌注心律失常及ST段的下降回落，心尖部位和左心室前壁恢復(fù)紅色，若ST段15 min內(nèi)下降50%則代表再灌注模型建立成功。正常心肌缺血再灌注組和糖尿病心肌缺血再灌注組在缺血30 min后，重新套疊移液槍頭又可結(jié)扎左前降支，并于再灌注前實(shí)施缺血后處理 （再灌注10 s，缺血10 s） 3個(gè)循環(huán)，再灌注120 min。

觀察指標(biāo)及技術(shù)方法：（1）測(cè)量心肌缺血及心肌梗死面積：除正常假手術(shù)組、糖尿病假手術(shù)組外，其余各組隨機(jī)取8只大鼠心臟，于再灌注120 min時(shí)，經(jīng)股靜脈注射1%Evans Blue 2 ml，取下心臟，置于-20℃ 30 min后，從心尖到心底縫線結(jié)扎部位分成三段，在中段同一平面垂直于長(zhǎng)軸方向?qū)⑵淝谐? mm厚的薄片，置于l%三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液（Sigma公司，美國(guó)）中37℃孵育20 min。存活的心肌呈藍(lán)色，缺血區(qū)心肌呈磚紅色，梗死區(qū)心肌呈灰白色。采用Imag-Pro軟件（Media Cybemetics公司，美國(guó)）分析計(jì)算梗死心肌與全部左心室心肌面積比。各組取其平均值。（2）光鏡下觀察梗死區(qū)病理變化：取壞死部位心肌、固定液固定24 h、蘇木素伊紅（HE）染色法染色后。光學(xué)顯微鏡（×100）觀察各組小鼠心肌梗死區(qū)的變化。（3）血漿檢測(cè)指標(biāo)：采用ELISA檢測(cè)血漿中脂聯(lián)素的含量。（4） 免疫印跡方法（Western blot方法）分析心肌組織p-Akt和總蛋白激酶B（Total-Akt）水平：每組大鼠自前降支結(jié)扎線以下心尖部取左心室缺血心肌組織100 mg，加入1 000 μl RIPA裂解液，及蛋白含量測(cè)定、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影等操作。Odyssey紅外掃描顯影儀掃描熒光條帶，Quantity one軟件進(jìn)行灰度測(cè)量，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

心肌缺血面積和梗死面積比較（表1）：與正常心肌缺血再灌注組比較，正常缺血后處理組梗死面積顯著降低， 糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組梗死面積顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01）；與糖尿病心肌缺血再灌注組相比，糖尿病缺血后處理組的心肌梗死面積無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心肌缺血面積和梗死面積的比較

表1 各組大鼠心肌缺血面積和梗死面積的比較

注：與正常心肌缺血再灌注組比較*P＜0.05**P＜0.01

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光鏡下心肌結(jié)構(gòu)的變化（圖1）：糖尿病假手術(shù)組，心肌纖維排列整齊有序，未見斷裂、變性壞死等改變，間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤(rùn)。糖尿病心肌缺血再灌注組及正常心肌缺血再灌注組心肌纖維排列紊亂、凝固性壞死、核脆裂、核消失，胞質(zhì)均質(zhì)紅染或不規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。糖尿病缺血后處理組與糖尿病心肌缺血再灌注組比較無改善，正常缺血后處理組與正常心肌缺血再灌注組比較心肌纖維排列較整齊，斷裂、變性壞死程度輕。

圖1 各組大鼠心肌組織鏡下觀（HE染色，×100）

各組大鼠血漿脂聯(lián)素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達(dá)（圖2、表2）：與正常假手術(shù)組比較：正常心肌缺血再灌注組和正常缺血后處理組血清脂聯(lián)素和p-Akt蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01～0.05）；糖尿病假手術(shù)組p-Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；其余各組脂聯(lián)素及p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常缺血后處理組比較：糖尿病假手術(shù)組、糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組脂聯(lián)素和p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01～0.05）。血漿脂聯(lián)素的表達(dá)水平與心肌梗死面積呈負(fù)相關(guān)，而與心肌組織中p-Akt表達(dá)水平呈正相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)分別為0.63和0.65，P＜0. 01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達(dá)的免疫印跡圖

表2 各組大鼠血漿脂聯(lián)素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠血漿脂聯(lián)素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達(dá)比較

注： 與正常假手術(shù)組比較*P＜0.05**P＜0.01；與正常缺血后處理組比較△P＜0.05△△P＜0.01。余注見圖2

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3 討論

脂聯(lián)素是Scherer等[9]于1995年從鼠的脂肪細(xì)胞中克隆出的一種新cDNA，近十年的實(shí)驗(yàn)與臨床發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素主要有三種生物學(xué)功能：胰島素增敏/代謝調(diào)節(jié)功能（主要是肝臟和肌肉）；抗炎/血管保護(hù)功能；抗缺血心肌保護(hù)功能[10]。脂聯(lián)素高表達(dá)，通過對(duì)巨噬細(xì)胞抗炎表型激活（或活化）的抑制作用，可以制止代謝和心血管疾病惡化[11]。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示伴有高血糖的肥胖和糖尿病患者中，脂聯(lián)素水平越低，其患心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)越高。血漿脂聯(lián)素濃度與胰島素水平負(fù)相關(guān)。脂聯(lián)素表達(dá)分泌受體內(nèi)一些炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子、激素等因素調(diào)節(jié)，如炎癥因子TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)抑制脂聯(lián)素的表達(dá)分泌，其中TNF-α可通過強(qiáng)烈抑制脂聯(lián)素啟動(dòng)子的活性而發(fā)揮作用。在肥胖狀態(tài)大多數(shù)脂肪因子是上調(diào)的，通常充當(dāng)前炎癥介質(zhì)促進(jìn)疾病過程。相反，脂聯(lián)素因肥胖而下調(diào)[12]。Walsh等證實(shí)脂聯(lián)素敲除小鼠對(duì)心肌缺血再灌注損傷易感性增加，并且在再灌注前給予脂聯(lián)素的重組體，可以顯著減少心肌梗死面積[13，14]。這些結(jié)果提示在Ⅱ型糖尿病患者中，脂聯(lián)素水平降低，不僅促進(jìn)了缺血性心肌病的發(fā)生，還加重了缺血再灌注后心肌細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果缺血再灌注尤其是缺血后處理引起脂聯(lián)素顯著升高，可以顯著減少心肌梗死面積；而糖尿病心肌中，脂聯(lián)素表達(dá)受到抑制，且缺血再灌注與缺血后處理均不能上調(diào)其表達(dá)水平，心肌梗死面積增大。提示糖尿病患者合并急性心肌梗死不能通過缺血后處理減少心肌梗死面積，相反是擴(kuò)大心肌梗死面積，惡化預(yù)后。

磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是維持細(xì)胞周期運(yùn)行，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要因素。在心肌細(xì)胞中PI3K/Akt通路的激活可減輕胞內(nèi)鈣超載，維持線粒體膜穩(wěn)定性，防止因線粒體膜通道孔（線粒體mPTP）的開放而導(dǎo)致的后續(xù)氧化損傷和凋亡反應(yīng)，是心肌細(xì)胞重要的內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制[15]。而缺血后處理作為重要的機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)措施，可通過PI3K/Akt通路激活發(fā)揮保護(hù)作用。高妮妮等[16]證實(shí)PI3K-AkteNOS信號(hào)通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌缺血再灌注損傷后缺血后處理的保護(hù)作用消失，進(jìn)一步研究顯示缺血后處理保護(hù)作用消失的機(jī)制與PI3K/Akt通路失活密切相關(guān)[17,18]。Wang等[19]證實(shí)N-乙酰半胱氨酸和別嘌呤醇協(xié)同減弱糖尿病大鼠缺血再灌注損傷機(jī)制通過脂聯(lián)素上調(diào)PI3K/Akt通路而實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)正常大鼠心肌缺血再灌注及缺血后處理后心肌梗死面積逐漸減小，心肌損傷壞死程度顯著減輕，脂聯(lián)素表達(dá)及p-Akt表達(dá)依次增高；而在糖尿病大鼠脂聯(lián)素表達(dá)及p-Akt表達(dá)降低，且缺血再灌注、缺血后處理均不能上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)，相

關(guān)p-Akt表達(dá)亦降低，在脂聯(lián)素的低表達(dá)及PI3K/ Akt通路失活作用下，增加了糖尿病心肌對(duì)缺血的敏感性，與Christopher等[20]研究結(jié)果相似，表明糖尿病缺血再灌注損傷加重不能通過缺血后處理實(shí)現(xiàn)對(duì)糖尿病心肌缺血的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明在正常心肌缺血再灌注及缺血后處理引起脂聯(lián)素升高且伴隨著p-Akt表達(dá)的升高，脂聯(lián)素與p-Akt的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。而糖尿病心肌中脂聯(lián)素表達(dá)受到抑制，且缺血再灌注損傷與缺血后處理均不能上調(diào)其表達(dá)，p-Akt的低表達(dá)使其無法通過調(diào)節(jié)PI3K/ Akt信號(hào)通路而發(fā)揮保護(hù)作用。在糖尿病合并急性心肌梗死行冠狀動(dòng)脈球囊擴(kuò)張及支架術(shù)缺血再灌注時(shí)，實(shí)施缺血后處理不能實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用。

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Effect of Adiponectin Levels With its Related Mechanism on Diabetic Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Experimental Rats

DENG Ying-zhong, CAO Chen, ZHENG Xing-ping, XUE Rui, LIU Fang, HU Er-man, TAN qi-rong.
Department of Cardiology, The Third Hospital of Wuhan City, Wuhan (430074), Hubei, China

Objective: To investigate the effect of adiponectin levels with its related mechanism in diabetic myocardial ischemia-reperfusion injury and ischemia post-conditioning in experimental rats.

2014-10-28）

（編輯：汪碧蓉）

武漢市臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（WX12D11）

430074 湖北省，武漢市第三醫(yī)院 心內(nèi)科（鄧應(yīng)忠、 曹晨 、鄭興萍 、 劉芳、胡鄂曼、譚啟榮）；武漢大學(xué)人民醫(yī)院（薛銳）

鄧應(yīng)忠 副主任醫(yī)師 學(xué)士 研究方向?yàn)樾难懿⊙芯?Email：dggxxmm@126.com 通訊作者：曹晨 Email：807439737@qq.com

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1000-3614（2015）09-0879-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.014