同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)的影響

吳 燕，王 怡，江巧玲，周佳麗，周 青，汪 淵，朱華慶

同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞肌球蛋白輕鏈激酶表達(dá)的影響

吳 燕，王 怡，江巧玲，周佳麗，周 青，汪 淵，朱華慶

目的研究同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）運(yùn)動(dòng)能力以及肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）表達(dá)的影響。方法不同濃度的Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)Hcy對(duì)HUVEC增殖的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hcy對(duì)細(xì)胞遷移的影響，免疫組化法及Western blot法檢測(cè)MLCK表達(dá)的變化。結(jié)果隨著濃度的升高，Hcy對(duì)HUVEC的增殖有顯著的抑制作用，對(duì)HUVEC的遷移有明顯的促進(jìn)作用，免疫組化法及Western blot法結(jié)果顯示Hcy可以增強(qiáng)MLCK的表達(dá)。結(jié)論Hcy對(duì)HUVEC的遷移具有促進(jìn)作用，可能是Hcy通過(guò)上調(diào)MLCK的表達(dá)所致。

同型半胱氨酸；動(dòng)脈粥樣硬化；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；肌球蛋白輕鏈激酶

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是大多數(shù)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，給人類健康帶來(lái)極大的威脅，而其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)［1－2］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含巰基氨基酸，是人體內(nèi)甲硫氨酸代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物，近年來(lái)，大量研究［3］證明同型半胱氨酸可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，是致AS的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是一種鈣調(diào)素依賴酶，能催化肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化，引起內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞骨架重排，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性［4］。該研究通過(guò)采用同型半胱氨酸處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilicalvein endothelial cells，HUVEC），初步探討了Hcy對(duì)HUVEC增殖、遷移能力的影響以及在此過(guò)程中MLCK表達(dá)的變化，為Hcy致AS的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC購(gòu)于美國(guó)ATCC公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、Hcy購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，MTT用PBS配制成5%母液，Hcy用純化水配制成200 mmol／L母液，分別過(guò)濾除菌，－20℃避光保存。BCA定量試劑盒、ECL顯色試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；免疫組化染色試劑盒、DAB試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司；鼠抗人β-actin、MLCK均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%（含0.53 mmol／L EDTA）的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，接種于96孔板中（3 000～4 000個(gè)／孔），邊緣孔用200 μl PBS填充。細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，每孔加入200 μl含不同濃度的Hcy（0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol／L）培養(yǎng)液，每組4個(gè)復(fù)孔，設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去原液，每孔加入200 μl新鮮DMEM培養(yǎng)液及20 μl MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震蕩10 min溶解結(jié)晶后于570 nm測(cè)吸光度（optical density，OD）。抑制率（%）＝（對(duì)照孔OD570－試驗(yàn)孔OD570）／對(duì)照孔OD570×100%。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) HUVEC用胰蛋白酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液均勻接種于12孔板中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用滅菌白槍頭在12孔板底部畫(huà)出井字形，PBS洗3次，洗去劃下的漂浮細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后在交叉線處拍照。拍照后換入含有不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培養(yǎng)液，每12 h拍照一次，拍照前后均要換液。Quantity One軟件測(cè)量每組細(xì)胞劃痕邊界的距離，細(xì)胞相對(duì)遷移率（%）＝（藥物處理前的距離－藥物處理后的距離）／藥物處理前的距離。

1.2.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，胰酶消化后接種于含有滅菌圓形蓋玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日細(xì)胞貼壁后分別加入含不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）的培養(yǎng)液，并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組及陰性對(duì)照組（PBS代替一抗孵育）培養(yǎng)48 h。取出6孔板，多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，PBS洗3遍，將蓋玻片取出置于載玻片上，吸干蓋玻片周圍PBS，山羊血清封閉10 min，加一抗4℃過(guò)夜。二抗孵育15 min，PBS洗3遍，加入鏈霉卵白素孵育15 min，PBS洗后DAB顯色。自來(lái)水沖洗后蘇木精復(fù)染，自來(lái)水返藍(lán)，分別經(jīng)95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5 Western blot 將細(xì)胞均勻接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后用不同濃度Hcy（0.1、0.5、1.0 mmol／L）處理48 h。冰PBS洗滌細(xì)胞后，加入蛋白提取液（Tris-HCl，pH 7.14；150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞刮下置－80℃及4℃冰箱反復(fù)凍融2～3次。14 000 r／min、4℃離心30 min后吸取上清液進(jìn)行BCA定量，將所有樣本調(diào)整為相同濃度并加入4×蛋白上樣緩沖液后煮沸，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%的凝膠，加樣后恒壓進(jìn)行SDSPAGE電泳，電泳結(jié)束后恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3%～5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBS洗3次后置于一抗［MLCK（1∶500）或β-actin（1∶1 000）］中孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，PBS洗3遍，在暗室中將等比例混合后的ECL試劑A液和B液均勻涂于膜上，覆蓋X線片曝光，顯影，定影。片子掃描后，用Quantity One軟件對(duì)其進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示。組間計(jì)量資料采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對(duì)HUVEC增殖的影響 MTT結(jié)果顯示Hcy能明顯抑制HUVEC在體外的增殖，并且抑制效果隨Hcy濃度的升高而增強(qiáng)，提示Hcy抑制HUVEC的增殖呈明顯的劑量依賴性（F＝13.866），見(jiàn)表1。

表1 不同濃度Hcy對(duì)HUVEC增殖的影響（n＝4，±s）

與細(xì)胞對(duì)照組比較：*P＜0.05

組別OD570值抑制率（%）細(xì)胞對(duì)照1.07±0.08－Hcy（mmol／L）0.11.00±0.0812.85*0.40.92±0.1029.27*0.60.83±0.0346.59*0.80.81±0.0846.70*1.00.77±0.0558.00*2.00.75±0.0262.07*

2.2 Hcy對(duì)HUVEC遷移的影響 HUVEC在加藥處理24 h和36 h后，Hcy組劃痕處的細(xì)胞明顯比細(xì)胞對(duì)照組多，且隨著藥物濃度的升高劃痕間隙越來(lái)越小，說(shuō)明Hcy可以明顯促進(jìn)HUVEC的遷移，且隨著藥物濃度的升高遷移效果越明顯（F＝56.61），見(jiàn)圖1。

2.3 細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MLCK的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示細(xì)胞對(duì)照組僅有極少量細(xì)胞著色且著色很淺；0.1 mmol／L Hcy處理細(xì)胞后棕黃色的MLCK表達(dá)量增強(qiáng)；0.5 mmol／L Hcy處理后可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)大量著色，且著色更深；1.0 mmol／L Hcy組染色細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，胞質(zhì)呈深棕黃色，見(jiàn)圖2。

2.4 Western blot檢測(cè)MLCK的表達(dá)不同濃度的Hcy作用于HUVEC 48 h后，結(jié)果顯示與細(xì)胞對(duì)照組相比Hcy處理后的細(xì)胞MLCK表達(dá)顯著增強(qiáng)，且隨著Hcy濃度的升高，細(xì)胞中MLCK的表達(dá)量逐漸加強(qiáng)（F＝62.276），見(jiàn)圖3。

3 討論

在人體內(nèi)，Hcy主要是甲硫氨酸脫甲基后的產(chǎn)物。Hcy有兩種代謝途徑，一方面可以通過(guò)轉(zhuǎn)硫作用生成半胱氨酸和α-酮丁酸，另一方面可以發(fā)生甲基化，重新形成甲硫氨酸，以保持體內(nèi)Hcy的平衡。與Hcy體內(nèi)合成和代謝相關(guān)的酶、葉酸、維生素B12等的缺乏都可能引起高同型半胱氨酸血癥［5］。AS是由多種因素共同參與的一種疾病，包括高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙等，而高同型半胱氨酸血癥是導(dǎo)致AS的一個(gè)重要因素，目前其機(jī)制尚未完全明確。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是附著于血管壁的單層表皮細(xì)胞，是血液和組織液之間的轉(zhuǎn)運(yùn)屏障，能合成和分泌多種活性物質(zhì)，保證血管正常的收縮和舒張，使循環(huán)血液保持流動(dòng)狀態(tài)，防止血栓形成。AS與內(nèi)皮細(xì)胞之間具有密切的聯(lián)系，AS的產(chǎn)生始于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。有研究［6－7］表明Hcy可以通過(guò)巰基發(fā)生自身氧化，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫、超陰離子和羥自由基等活性氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷，同時(shí)，釋放的大量炎癥因子會(huì)破壞血管內(nèi)皮，引起內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)一步加劇AS的發(fā)展。該研究采用體外培養(yǎng)HUVEC，經(jīng)不同濃度Hcy處理后，MTT結(jié)果顯示與細(xì)胞對(duì)照組相比較，Hcy組細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且抑制效果呈濃度依賴性。

近年來(lái)研究［8］顯示MLCK在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞收縮以及血管內(nèi)皮屏障功能中發(fā)揮著重大作用，是MLC磷酸化的重要調(diào)節(jié)蛋白。MLC磷酸化水平與骨架收縮活動(dòng)直接相關(guān)，MLCK表達(dá)增加可以上調(diào)MLC磷酸化水平，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮加劇，通透性增加，細(xì)胞形態(tài)和功能完整性遭到破壞，脂質(zhì)更容易發(fā)生浸潤(rùn)［9］。該研究Western blot以及免疫組化結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，Hcy處理組細(xì)胞中MLCK的表達(dá)量顯著上升，且隨著藥物濃度的升高而增加，提示Hcy可以上調(diào)MLCK的表達(dá)。MLC的磷酸化水平與細(xì)胞遷移也是密切相關(guān)的，MLCK誘導(dǎo)細(xì)胞周邊和前端MLC磷酸化，磷酸化的MLC加強(qiáng)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白微絲的相互作用，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移［10］。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示Hcy處理HUVEC 24 h及36 h后，在顯微鏡下可以觀察到劃痕距離的縮短，且隨著藥物濃度的升高，劃痕距離的縮短更加顯著，從而提示Hcy可以促進(jìn)HUVEC的遷移。

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The effect of homocysteine on the expression of MLCK in human umbilicalvein endothelial cells

Wu Yan，Wang Yi，Jiang Qiaoling，et al
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，Anhui Medical University，Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effect of homocysteine（Hcy）on movement ability and expression of myosin light chain kinase（MLCK）in human umbilicalvein endothelial cells（HUVEC）.MethodsMTT assay was detected to measure the proliferation of HUVEC treated with different concentrations of homocysteine.The effect of Hcy on migration of HUVEC was measured by wound healing assay.The expression of MLCK was analyzed by immunohistochemistry and Western blot.ResultsWith the increase of concentration，Hcy could inhibit the proliferation of HUVEC and promote the migration of HUVEC remarkably.Immunohistochemistry and Western blot showed that Hcy could enhance the expression of MLCK significantly.ConclusionHcy can promote the migration of HUVEC，which may relate to the up-regulation of expression of MLCK

Hcy；atherosclerosis；HUVEC；MLCK

R 966；R 541.4；R 34

1000－1492（2015）01－0012－04

2014－09－11接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81070232、81270372）

安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、生物化學(xué)與分子生物學(xué)

教研室、安徽?。〔抗步ń逃恐匾z傳病基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

吳 燕，女，碩士研究生；

朱華慶，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydzhq＠126.com