促紅細(xì)胞生成素衍生肽抑制大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用研究*

王琛，司瑞，張明明，余文軍，郝啟萌，張榮慶，王海昌

促紅細(xì)胞生成素衍生肽抑制大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注損傷的作用研究*

王琛，司瑞，張明明，余文軍，郝啟萌，張榮慶，王海昌

目的：探討促紅細(xì)胞生成素衍生肽（HBSP）抑制大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）缺血/再灌注損傷的作用及其機(jī)制。

方法：分離培養(yǎng)大鼠CMECs，建立缺血/再灌注損傷模型，隨機(jī)分為對照組、模擬缺血/再灌注組（SI/R組）、SI/R＋重組人促紅細(xì)胞生成素組（SI/R+rhEPO組）、SI/R＋HBSP組；HBSP分別選擇2.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml四個濃度，通過噻唑藍(lán)（MTT）比色實驗檢測CMECs增殖能力以確定藥物作用的最適濃度。而后采用細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡率來進(jìn)一步驗證其保護(hù)作用。研究保護(hù)機(jī)制的實驗分組為：對照組、SI/R組、SI/R＋HBSP（HBSP最適濃度為25 ng/ml）組、SI/R+HBSP+磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制劑（LY294002）組、SI/R+HBSP+雷帕霉素組，采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白激酶B（AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）等蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。

結(jié)果：與SI/R組比，SI/R+rhEPO組和SI/R+HBSP組CMECs增殖能力明顯上升（P＜0.05），凋亡率顯著下降（P＜0.01），遷移能力增強(qiáng)。用抑制劑LY294002及雷帕霉素處理后，與SI/R組相比，SI/R+HBSP組AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均顯著提高（P＜0.05）；與SI/R+HBSP組相比，SI/R+HBSP+LY294002組的AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均顯著下降（P＜0.05），SI/R+HBSP+雷帕霉素組mTOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平顯著下降（P＜0.05）。

結(jié)論：HBSP能夠抑制缺血/再灌注誘導(dǎo)的CMECs的損傷，其保護(hù)作用可能與PI3K-AKT/mTOR信號通路激活有關(guān)。

促紅細(xì)胞生成素衍生肽；心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；缺血/再灌注損傷；細(xì)胞凋亡

Methods: The CMECs were isolated from SD rats to establish I/R model, and the cells were randomly divided into 4 groups: ①Control group, ②Simulated ischemia/reperfusion (SI/R) group, ③SI/R + rhEPO group, ④SI/R + HBSP group, in which the reperfusion medium contained HBSP at 2.5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml respectively. MTT method showed that HBSP 25 ng/ml was the best concentration to detect CMECs proliferation. The protective experiment was divided into 5 groups: ①Control group, ②SI/R group, ③SI/R + HBSP (25 ng/ml) group, ④SI/R + HBSP + PI3K inhibitor LY294002 group and ⑤SI/R + HBSP + Rapamycin group. The protein expressions of AKT, mTOR and p70S6K were examined by Western blot analysis.

Results:①Compared with SI/R group, SI/R + rhEPO group and SI/R + HBSP group had increased CMECs

proliferation, increased migration ability, P＜0.01 and decreased apoptosis rate, P＜0.01.②Compared with SI/R group, SI/R + HBSP group increased the phosphorylation level of AKT, mTOR and p70S6K, P＜0.05. ③compared with SI/R + HBSP group, SI/R + HBSP + PI3K inhibitor LY294002 group presented decreased phosphorylation level of AKT, mTOR and p70S6K, P＜0.05; SI/R + HBSP + Rapamycin group had decreased phosphorylation level of mTOR and p70S6K, P＜0.05.

Conclusion: HBSP may protect CMECs from I/R injury in experimental rats, which might be related to the activation of PI3K-AKT/mTOR signal pathway.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:280.)

心肌缺血/再灌注損傷（I/RI）是急性心肌梗死患者血管再通治療時常伴隨著的重要病理生理過程，不僅發(fā)生率高，而且影響血管再通治療效果，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡。以往研究證實，促紅細(xì)胞生成素（EPO）除具有治療貧血作用外，還可對心臟、腎臟等重要器官發(fā)揮保護(hù)作用[1,2]。但發(fā)揮此保護(hù)作用需要給予較高濃度，易產(chǎn)生紅細(xì)胞增多、血黏度增高等嚴(yán)重不良反應(yīng)，額外增加了心血管疾病危險因素，極大限制了EPO的臨床應(yīng)用。Brines等[3]通過分析EPO空間構(gòu)象，合成了一種11個氨基酸殘基組成的線性多肽鏈——促紅細(xì)胞生成素衍生肽（HBSP），在動物模型中顯示出良好的組織保護(hù)作用，且無促紅細(xì)胞生成的不良反應(yīng)。本課題組前期研究結(jié)果亦證實，HBSP可顯著抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷，減少梗死面積[4]。但是HBSP對I/ RI的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）是否具有保護(hù)作用及其可能涉及的機(jī)制并未見報道。本研究通過建立模擬缺血/再灌注模型，觀察HBSP對于缺血/再灌注的CMECs是否有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其具體機(jī)制。

1 材料與方法

實驗動物和材料：2013-07至2014-08納入雄性SD大鼠10只，體重80～100 g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。HBSP（純度≥98%）購自上?？齐纳锟萍加邢薰尽Ｖ亟M人EPO（rhEPO）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）特異性抑制劑LY294002購自美國Millipore公司。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）特異性抑制劑雷帕霉素購于美國Cell signaling公司。蛋白激酶B（AKT）抗體及磷酸化蛋白激酶B（pAKT）抗體、mTOR抗體及磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR）抗體、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）抗體及磷酸化核糖體S6蛋白激酶（pp70S6K）抗體來自美國Abcam公司。

CMECs分離培養(yǎng)及鑒定：采用酶消化法分離CMECs，具體步驟見參考文獻(xiàn)[5]。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，具體步驟見參考文獻(xiàn)[6]。

模型的建立及分組：模擬缺血/再灌注（SI/R）模型的建立見參考文獻(xiàn)[7]。更換培養(yǎng)液為缺血液（含NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2·2H2O、HEPES、脫氧葡萄糖、連二硫酸鈉、乳酸；pH=6.5），37℃缺氧孵箱內(nèi)孵育2 h后，更換正常培養(yǎng)液或含藥物的培養(yǎng)液，37℃5% CO2孵箱內(nèi)孵育4 h后進(jìn)行各項檢測。CMECs隨機(jī)分組:①對照組：正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加任何干預(yù)；②模擬缺血/再灌注組（SI/R組）；③模擬缺血/再灌注+重組人促紅細(xì)胞生成素組（SI/ R+rhEPO組）：再灌注時更換加入含rhEPO 10 IU/ ml的培養(yǎng)液；④模擬缺血/再灌注+促紅細(xì)胞生成素衍生肽組（SI/R+HBSP組）：再灌注時更換加入含不同濃度的HBSP（2.5、25、50、100 ng/ml）的培養(yǎng)液。確定HBSP的最適濃度后，用此濃度進(jìn)行細(xì)胞遷移能力及凋亡率的測定。研究保護(hù)機(jī)制的實驗分組：①對照組；②SI/R組；③SI/R+HBSP組：HBSP最適濃度為25 ng/ml；④SI/R+HBSP+磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制劑（LY294002）組：再灌注液除含HBSP外，還含有30 μmol/L的LY294002；⑤SI/ R+HBSP+雷帕霉素組：再灌注液除含HBSP外，還含有10 nmol/L的雷帕霉素。

噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞增殖能力：參照文獻(xiàn)[8]，取同一批的CMECs，將細(xì)胞密度調(diào)整至5×104/ml接種于96孔板，每組接種100 μl，每組設(shè)5個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至80%匯合后，按上述方法進(jìn)行分組及造模。復(fù)氧結(jié)束后加入MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)的上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處測定各孔吸光度（A） 值。

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端

標(biāo)記測定（TUNEL）法檢測CMECs的凋亡率：制備細(xì)胞爬片，按上述方法分組及造模后，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。冷丙酮室溫固定20 min后，0.1%Triton X-100孵育2 min（冰上），磷酸鹽緩沖液（PBS，成分為NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）沖洗。加入TUNEL混合溶液，37℃避光孵育1 h。續(xù)用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）室溫孵育10 min，PBS沖洗?？篃晒獯銣鐒┓馄螅跓晒怙@微鏡下觀察并拍照。TUNEL染色陽性為凋亡細(xì)胞，呈綠色熒光，DAPI對所有細(xì)胞核進(jìn)行染色，呈藍(lán)色熒光。每張爬片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)，統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，取其平均值。凋亡率（AI）=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

細(xì)胞劃痕法測定CMECs的遷移能力：參照文獻(xiàn)[8]，取同一批CMECs，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/ml接種于6孔板，每孔接種2 ml，待細(xì)胞后生長匯合后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用200 μl移液器槍頭垂直于培養(yǎng)板底部均勻劃痕。將孔板置于倒置顯微鏡下拍照，每孔任選3個視野拍照記錄劃痕區(qū)的相對距離。而后按上述方法進(jìn)行隨機(jī)分組，模型建立后繼續(xù)以含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出拍照，記錄各組劃痕后的相對距離，測定CMECs的遷移能力。

免疫蛋白印跡法（Western Blot）檢測AKT等相關(guān)蛋白的表達(dá)：預(yù)冷PBS沖洗收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，低溫離心后取上清，參照文獻(xiàn)[9]，按照二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。而后采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）后，置于含5%脫脂乳的TBST封閉緩沖液（含有 Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=7.4）中封閉，加入pAKT、pmTOR、pp70S6K一抗4℃孵育過夜。加二抗37℃孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法曝光后觀察結(jié)果。隨后Stripping 緩沖液解離一抗，漂洗并重新封閉印跡膜，檢測三種信號分子AKT、mTOR、p70S6K的表達(dá)。采用Bio-image（Bio-Rad）分析軟件采集信號和灰度掃描。

統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，再以LSD-t檢驗分析相應(yīng)兩組差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

CMECs的鑒定：CMECs吞噬Alexa594紅色熒光標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL）后，細(xì)胞質(zhì)呈紅色熒光，DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。圖1

圖1 心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定（×400）

CMECs增殖能力的檢測：與對照組（0.411±0.020）相比，SI/R組（0.180±0.010）吸光度值明顯下降（ P＜0.01）。再灌注時與SI/R組比，SI/R＋rhEPO組以rhEPO作用于CMECs后，吸光度值顯著增高為0.245±0.015（P＜0.05），SI/R+HBSP組以不同濃度的HBSP（2.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml）作用于CMECs后，吸光度值均增高，分別為0.241±0.011、0.320±0.010、0.282±0.014、0.263±0.017（P＜0.05）；不同濃度的HBSP相比，中濃度HBSP（25 ng/ml）時，CMECs增殖能力最強(qiáng)（圖2）。此濃度為最適濃度，后續(xù)研究保護(hù)機(jī)制的實驗用此濃度進(jìn)行。

圖2 噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力

HBSP對SI/R誘導(dǎo)的凋亡的影響：與對照組（3.54%±0.21%） 相比，SI/R組（41.1%±0.8）的CMECs的凋亡率顯著增加（P＜0.001）；與SI/R組（41.1%±0.8%）相比，rhEPO組（25.5%±0.43%）凋亡率降低（P＜0.01）；與SI/R組和SI/R+rhEPO組

相比，HBSP（25 ng/ml）組凋亡率顯著下降，為16.9%±0.78%（P＜0.01）。

CMECs遷移能力比較：細(xì)胞劃痕實驗顯示，與對照組相比，再灌注24 h后SI/R組圖3E中劃痕后的相對距離較寬（細(xì)胞遷移能力明顯減弱）；而與SI/R組相比，SI/R+HBSP組圖3F中劃痕后的相對距離縮窄（細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)）。圖3

圖3 細(xì)胞劃痕實驗檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力圖（×100）

AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平改變：Western blot 檢測顯示，與SI/R組相比，SI/R+HBSP組AKT的磷酸化水平顯著增加（P＜0.05），這一效應(yīng)可被PI3K抑制劑LY294002（30 μmol/L）部分抵消（P＜0.05），而雷帕霉素（10 nmol/L）的使用則對AKT的磷酸化水平無明顯影響（圖4A）。

因上游調(diào)控AKT的方式之一是依賴PI3K，當(dāng)使用LY294002后可阻止此信號通路，下調(diào)AKT的磷酸化表達(dá)；而mTOR位于AKT下游，故雷帕霉素的使用對AKT的活化無影響。與SI/R組相比，SI/R+HBSP組mTOR的磷酸化水平亦有顯著性提高，這一效應(yīng)可被LY294002及雷帕霉素部分抵消（P＜0.05，圖4B）。

同樣，與SI/R組相比，HBSP組mTOR下游分子p70S6K的磷酸化水平也顯著性增高，而使用LY294002及雷帕霉素處理后，這一效應(yīng)被部分消除（P＜0.05，圖4C）。

圖4 免疫印跡法檢測心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平

3 討論

I/RI機(jī)制復(fù)雜。近年來研究發(fā)現(xiàn)，I/RI在微血管水平的病理變化主要表現(xiàn)為 CMECs 正常屏障功能損傷和細(xì)胞凋亡[5]。并且，研究證實在再灌注早期，CMECs的凋亡要早于心肌細(xì)胞， 并可通過釋放一些炎性介質(zhì)，促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，提示減少再灌注后CMECs 的凋亡將對抑制心肌I/RI具有重要作用[10]。

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是由腎臟合成并分泌的一種激素。以往研究發(fā)現(xiàn)EPO在減少I/RI心肌細(xì)胞凋亡、縮小梗死面積、改善梗死后心功能和心肌重構(gòu)等方面有重要保護(hù)作用[11]。然而，研究數(shù)據(jù)顯示，EPO發(fā)揮組織保護(hù)作用的最低濃度要遠(yuǎn)高于其發(fā)揮促紅細(xì)胞生成作用的最低濃度，在組織損傷初期，需要極高濃度的EPO才能發(fā)揮組織保護(hù)作用，從而大量紅細(xì)胞生成導(dǎo)致的不良反應(yīng)成為難以調(diào)和的矛盾[12]。鑒于此，Brines等[3]通過分析EPO空

間構(gòu)象，合成了一種由11個氨基酸殘基構(gòu)成的線性多肽鏈（Helix B-surface peptide），并進(jìn)一步證實HBSP可特異性結(jié)合EPO βc受體（CD131），促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)，即使重復(fù)給藥也不會增加紅細(xì)胞和血小板數(shù)量[13]。最新研究顯示HBSP可顯著減少大鼠心梗模型心肌梗死面積,減少TNF-α誘導(dǎo)的離體心肌細(xì)胞凋亡[14]。我們課題組前期研究亦證實，HBSP可抑制在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷[4]。

但是，HBSP對大鼠I/RI的離體CMECs是否具有保護(hù)作用還不明確。本研究結(jié)果顯示，I/RI可抑制CEMCs的增殖能力和遷移能力，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與以往文獻(xiàn)結(jié)果相似[15]。而再灌注時給予HBSP，可顯著增加CMECs的增殖能力，提高CMECs的遷移能力，抑制I/RI誘導(dǎo)的CMECs凋亡。近年來研究顯示，EPO和HBSP均可通過激活A(yù)KT通路顯著抑制腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的離體心肌細(xì)胞凋亡[14]。我們的前期研究結(jié)果亦證實，HBSP可通過激活PI3K/AKT通路，抑制在體大鼠I/RI[4]。但其對I/RI的離體CMECs的保護(hù)作用及其具體機(jī)制尚未研究。我們的研究結(jié)果顯示，與SI/R組相比，HBSP可上調(diào)AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化表達(dá)；而采用PI3K特異性抑制劑LY294002、mTOR特異性抑制劑雷帕霉素后，與HBSP組相比，AKT等相關(guān)蛋白的磷酸化水平顯著下降，提示HBSP對I/RI的CMECs的保護(hù)作用可能與PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)。

由于CMECs在心肌微循環(huán)中的特異性，其可作為預(yù)測血管功能的指標(biāo)之一，如何保護(hù)I/RI過程中的CMECs，已成為心血管病防治的重要內(nèi)容之一。心臟內(nèi)EPO受體也在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而HBSP作為EPO衍生物，可特異性結(jié)合EPO受體，故用HBSP治療能夠防止再灌注期內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心肌，維持血流，且避免了EPO促血栓形成等副作用。由于凋亡活性在再灌注期達(dá)到頂峰，所以對于接受溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后的患者應(yīng)用HBSP治療可能獲得明顯的益處。

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Investigation of Helix B-surface Peptide Protecting the Cardiac Micro-vascular Endothelial Cell Injury by Ischemia/reperfusion in Experimental Rats

WANG Chen, SI Rui, ZHANG Ming-ming, YU Wen-jun, HAO Qi-meng, ZHANG Rong-qing, WANG Hai-chang.
Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an (710032), Shan’xi, China

Objective: To investigate the effect of Helix B-surface peptide (HBSP) reducing the cardiac micro-vascular endothelial cells (CMECs) injury by ischemia/reperfusion (I/R) in experimental rats with possible mechanisms.

Helix B-surface peptide; Cardiac micro-vascular endothelial cells; Ischemia/reperfusion injury; Apoptosis

2014-10-18）

（編輯：許 菁）

國家自然科學(xué)基金（81200100）

710032 陜西省西安市，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

王琛 碩士研究生 主要從事心血管病學(xué)研究 Email: wangchen1398@sina.com 通訊作者：王海昌 Email: wanghc@fmmu.edu.cn

R54

A

1000-3614（2015）03-0280-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.020