曲美他嗪干預(yù)對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響

馮翔宇，趙亮，馮佩明，李秀華

曲美他嗪干預(yù)對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響

馮翔宇，趙亮，馮佩明，李秀華

目的：探討曲美他嗪干預(yù)對心力衰竭（心衰）大鼠左心室心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白和細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響。

方法：雄性wistar大鼠30只隨機(jī)分為假手術(shù)組、心衰模型組、曲美他嗪組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余兩組大鼠采用腎上腹主動(dòng)脈縮窄法建立慢性心衰模型，其中曲美他嗪組大鼠給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃4 w。觀察各組左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室壓力最大上升及下降速率（±dp/dtmax）；蘇木素伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)；原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）；SP免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠左心室心肌細(xì)胞caspase-3蛋白、細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：與假手術(shù)組比較，心衰模型組大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)發(fā)生明顯改變，排列紊亂，空泡變性，LVEDP顯著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明顯降低（P＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與心衰模型組相比，曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)變化明顯改善，LVEDP明顯下降（P＜0.01），±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

結(jié)論：曲美他嗪可有效改善心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體功能有關(guān)。

心力衰竭；細(xì)胞凋亡；線粒體； caspese-3蛋白；細(xì)胞色素C蛋白

Methods: A total of 30 male Wister rats were randomly divided into 3 groups: Sham group, the rats received operation without constriction, followed by intragastric administration of normal saline, n=10; the rest animals received suprarenal aortic constriction to establish HF model and further divided into 2 group: HF model group, the rats received intragastric administration of normal saline and Trimetazidine group, the rats received intragastric administration of timetazidine at 10 mg/(kg·d). n=10 in each group, all animal were treated for 4 weeks. Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and the maximum left ventricular pressure rising and falling (±dp/dtmax) were measured. The morphology of myocardium was observed by HE staining, myocardial ultra-structure was examined by transmission electronic microscopy, apoptotic index (AI) was detected by TUNEL assay. The expressions of caspase-3 and cytochrome C were evaluated by immunohistochemistry.

Results: Compared with Sham group, the rats in HF model group showed the morphological changes of myocardial mitochondria as disordered structure with vacuolar degeneration; increased LVEDP, P＜0.01 and decreased (±dp/dtmax),

P＜0.01; elevated AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01. Compared with HF model group, the rats in Trimetazidine group presented obviously improved myocardial mitochondrial morphology, much lower LVEDP, P＜0.01 and higher (±dp/dtmax), P＜0.01; reduced AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01.

Conclusion: Trimetazidine may effectively improve cardiac function and inhibit cadiomyocyte apoptosis, which might be related to the protection of mitochondrial function in experimental HF rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:276.)

心力衰竭（心衰）作為各種心臟病的終末階段，其發(fā)生發(fā)展中存在著心肌缺血及凋亡事件，這些都與心肌代謝密切相關(guān)[1,2]。曲美他嗪是一種改善心肌代謝的藥物，主要用于抗心絞痛的治療。目前研究表明，曲美他嗪在治療心衰中可有效干預(yù)心肌能量代謝，抑制心肌細(xì)胞凋亡[3]，但其具體作用機(jī)制，亟需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過縮窄大鼠腎上腹主動(dòng)脈建立慢性心衰模型，探討曲美他嗪干預(yù)對心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

材料：本實(shí)驗(yàn)于2013-01至2014-01選取清潔級雄性Wistar大鼠30只購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證編號：2009-0004）；鹽酸曲美他嗪（瑞陽制藥有限公司）；原位缺口粒端標(biāo)記（TUNEL）法試劑盒（美國羅氏公司）；caspase-3兔抗多克隆抗體（武漢博士德公司）；細(xì)胞色素C蛋白兔抗多克隆抗體（美國Santa cruz公司），SP免疫組織化學(xué)試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型建立：清潔級雄性Wistar大鼠30只，200～230 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按隨機(jī)數(shù)字隨機(jī)分為假手術(shù)組、心衰模型組、曲美他嗪組，每組10只。利用腎上腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)處理心衰模型組和曲美他嗪組大鼠復(fù)制慢性心衰模型[4,5]。制作步驟：將三組大鼠均用3%戊巴比妥鈉0.15 ml/100 g腹腔注射麻醉，剪毛后在腹部劍突下沿正中線切開皮膚2～3 cm，分層切開腹腔，分離出的腹主動(dòng)脈，用“0”號絲線穿過左腎動(dòng)脈上方，用絲線將腹主動(dòng)脈和磨鈍的7號手術(shù)針一同結(jié)扎，注意松緊度，然后抽出手術(shù)針，確定腹主動(dòng)脈通暢后分層關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠只分離腹主動(dòng)脈不予結(jié)扎。各組大鼠術(shù)后均給予20萬單位青霉素腹腔注射，連續(xù)給藥3天。

模型成功標(biāo)準(zhǔn)及處理方案：常規(guī)喂養(yǎng)4 w后，心衰模型組和曲美他嗪組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、體重增長緩慢、脫毛等表現(xiàn)，測血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為左心室舒張末期壓（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。造模成功后曲美他嗪組大鼠每天給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃，心衰模型組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4 w[6,7]。

血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測：至各大鼠實(shí)驗(yàn)8 w后將大鼠測體重后，按0.15 ml/100 g給予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，接通壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，監(jiān)測大鼠LVEDP，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。

標(biāo)本留?。好拷M隨機(jī)抽去2只取左心室前壁1 mm×1 mm×1 mm大小的組織2～3塊，先用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸后固定，用于透射電鏡觀察。取各組剩余8只大鼠部分左心室固定在4%多聚甲醛中留待石蠟包埋用于蘇木素伊紅（HE）染色、TUNEL法、免疫組織化學(xué)法檢測。

形態(tài)學(xué)觀察：HE染色觀察各組大鼠心肌細(xì)胞的大體結(jié)構(gòu)；透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

TUNEL法檢測心肌凋亡指數(shù)（AI）：用TUNEL法，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，細(xì)胞核染成棕褐色為陽性細(xì)胞。在高倍視野（×400）下每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)觀察6個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)各取平均值，按公式：凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3蛋白和細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)情況:嚴(yán)格按免疫組化試劑盒步驟操作，抗體工作濃度均為1：50，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。caspase-3蛋白和細(xì)胞色素C蛋白陽性產(chǎn)物為分布于細(xì)胞質(zhì)的棕黃色顆粒。用WiVnt圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)

觀察4個(gè)高倍鏡視野，用陽性產(chǎn)物面積/視野面積表示該抗原的相對含量，取其平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVE），兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較：與假手術(shù)組比較，心衰模型組和曲美他嗪組LVEDP顯著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與心衰模型組比較，曲美他嗪組LVEDP明顯下降（P＜0.01），±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與心力衰竭模型組比較△P＜0.01。LVEDP：左心室舒張末壓+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大上升速率 -dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大下降速率。1 mmHg=0.133 kPa

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光學(xué)顯微鏡下HE染色各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)改變：假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，無炎細(xì)胞浸潤；心衰模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞部分肥大、水腫，結(jié)構(gòu)模糊，可見炎細(xì)胞；曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞介于其他兩組之間，心肌改變較模型組有所改善。圖1

圖1 光學(xué)顯微鏡下蘇木素伊紅染色各組大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)改變（×400）

透射電鏡下各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變：假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞線粒體大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清晰完整，肌纖維排列整齊；心衰模型組大鼠心肌細(xì)胞線粒體大小不一，腫脹，可見空泡樣變，結(jié)構(gòu)不完整，部分線粒體嵴溶解斷裂，肌纖維水腫，排列紊亂，甚者斷裂；曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞線粒體腫脹不明顯，有變形，線粒體嵴排列稍紊亂，肌纖維排列較整齊，存在輕度溶解。圖2

圖2 透射電鏡下各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變（×3000）

TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）：假手術(shù)組僅有少量凋亡細(xì)胞，心衰模型組和曲美他嗪組均較假手術(shù)組的凋亡細(xì)胞增多（P＜0.01），與心衰模型組比曲美他嗪組大鼠心肌凋亡細(xì)胞減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表2、圖3

免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠心肌組織caspase-3蛋白和細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)：各組大鼠心肌細(xì)胞caspase-3蛋白與細(xì)胞色素C蛋白的陽性表達(dá)均為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中。假手術(shù)組僅有少量caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C表達(dá)。與假手術(shù)組比較，心衰模型組和曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞的caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯增多顏色明顯加深；與心衰模型組比較，曲美他嗪組大鼠心肌細(xì)胞的caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表2、圖4、圖5

圖3 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡（×400）

圖4 免疫組織化學(xué)二氨基聯(lián)苯胺染色法檢測各組大鼠心肌組織caspase-3蛋白的表達(dá)（×400）

圖5 免疫組織化學(xué)二氨基聯(lián)苯胺染色法檢測各組大鼠心肌組織細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)（×400）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與心力衰竭模型組比較△P＜0.01

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3 討論

心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序被某些刺激因子啟動(dòng)，在心衰的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，其中線粒體途徑是一個(gè)非常重要的通路系統(tǒng)[8]。細(xì)胞色素C蛋白是啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的關(guān)鍵因子，而caspase-3蛋白是各種凋亡路徑級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，在線粒體途徑凋亡途徑中也具有重要作用[9]。研究表明，在一些凋亡刺激信號作用下，線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔的孔徑增大，使得線粒體的外膜被破壞，使本來存在于線粒體的細(xì)胞色素C蛋白釋放到胞質(zhì)當(dāng)中[10]。細(xì)胞色素C蛋白可以與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、caspase-9前體、dATP結(jié)合成凋亡復(fù)合體，使caspase-9活化，然后激活caspase-3蛋白，抑制DNA修復(fù)酶活性，激活細(xì)胞核的內(nèi)切酶，切割DNA最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

心衰時(shí)心肌細(xì)胞處于能量代謝重構(gòu)狀態(tài)，心肌能量代謝功能障礙最終加速心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心室重塑[2,12]。曲美他嗪作為影響心肌代謝類藥物，可促使心肌細(xì)胞的代謝由游離脂肪酸β-氧化，向葡萄糖的有氧氧化轉(zhuǎn)換，進(jìn)而優(yōu)化心肌能量代謝；與此同時(shí)，曲美他嗪可抑制氧自由基的產(chǎn)生、抑制Na+及Ca2+的超載、減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒，保護(hù)細(xì)胞線粒體膜的穩(wěn)定性[13,14]。

本實(shí)驗(yàn)研究，用曲美他嗪干預(yù)的心衰大鼠，觀察各組大鼠的心功能、血液流變情況、線粒體超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡指數(shù)及大鼠心肌細(xì)胞caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)，來探討曲美他嗪在心衰治療中的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)表明曲美他嗪可改善心衰大鼠的心功能，改善心肌細(xì)胞線粒體的病變，降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，下調(diào)心衰大鼠心肌細(xì)胞caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)。

綜上所述，曲美他嗪具有改善心功能，抑制細(xì)胞凋亡，延緩心衰的作用，其機(jī)制可能與改善心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)，降低caspase-3蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞色素C釋放，抑制caspase-3蛋白活性有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Effect of Trimetazidine on Myocardial Ultra-structure, Cardiomyocyte Apoptosis and Expressions of Caspase-3, Cytochrome C in Experimental Rats With Heart Failure

FENG Xiang-yu, ZHAO Liang, FENG Pei-ming, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China

Objective: To investigate the effect of trimetazidine on myocardial ultra-structure, cardiomyocyte apoptosis, and expressions of caspase-3, cytochrome C in experimental rats with heart failure (HF).

Heart failure; Apoptosis; Mitochondrial; Caspase-3; Cytochrome C

2014-04-24）

（編輯：梅 平）

067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 老年病科（馮翔宇、李秀華），神經(jīng)內(nèi)科（趙亮），超聲科（馮佩明）

馮翔宇 碩士研究生 主要從事慢性心力衰竭的臨床及病理生理研究 Email：fengxiangyu_1@126.com 通訊作者：李秀華

Email：Lixiuhua76@126.com

R541

A

1000-3614（2015）03-0276-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.019