雞傳染性法氏囊病的實(shí)驗(yàn)室診斷

梁曉君 福建省南靖縣畜牧技術(shù)服務(wù)站363600

雞傳染性法氏囊病的實(shí)驗(yàn)室診斷

梁曉君 福建省南靖縣畜牧技術(shù)服務(wù)站363600

采集病死雞法氏囊經(jīng)處理后絨毛尿囊膜途徑接種5枚SPF雞胚，接種胚均于接種后48～96 h死亡，死亡胚病變特征為體表和皮下出血，胚水腫，腎臟出血，肝臟有壞死灶，心肌蒼白。瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果顯示法氏囊樣品孔、絨毛尿囊膜樣品孔與標(biāo)準(zhǔn)血清孔間均可出現(xiàn)明顯的沉淀線，說明樣品中含有傳染性法氏囊病病毒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查情況，診斷為雞傳染性法氏囊病。

雞傳染性法氏囊病實(shí)驗(yàn)室診斷

雞傳染性法氏囊病，是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性、高度接觸性傳染病。其發(fā)病率較高，且病程較短。各品種雞均能感染，雛雞被感染后，會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，并可能使多種疫苗免疫失敗或誘發(fā)疫病的產(chǎn)生，給養(yǎng)殖戶（業(yè)）造成的危害和經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。

2013年5月18日，南靖縣山城鎮(zhèn)某養(yǎng)雞戶所養(yǎng)的3 700多羽土雞發(fā)生疫病，發(fā)病日齡為40日齡，主要癥狀是患雞排白色水樣稀糞，且肛門周圍有糞便污染，羽毛蓬亂，發(fā)病率100%，病死率41%。病初戶主用頭孢氨芐、慶大霉素、滅毒清等藥物對(duì)患雞進(jìn)行治療，但效果甚微，于5月20日上午送南靖縣動(dòng)物疫控中心化驗(yàn)室檢驗(yàn)，根據(jù)臨床診斷、病理變化觀察及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果，確診為雞傳染性法氏囊病。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、10日齡SPF雞胚；主要試劑包括瓊脂、氯化鈉、蒸餾水、磷酸緩沖液鹽水、青霉素、鏈霉素等；試驗(yàn)器材包括培養(yǎng)皿、打孔器、移液器等。

1.2 臨床診斷對(duì)送檢的5羽病死雞逐一進(jìn)行剖檢，觀察其病理變化。

1.3 病料采集與處理采集具有典型病變的法氏囊，用加有抗生素（1 000 IU/mL青霉素和1 000 μg/ mL鏈霉素）的PBS制備成20%勻漿液，3 000×g離心10 min，收集上清液，置4℃作用1～4 h，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雞胚接種：取處理好的病料0.2 mL，通過絨毛尿囊膜途徑接種到5枚10日齡SPF雞胚中。具體方法為：取10日齡SPF雞胚，選擇一處血管比較少的部位，在卵殼上鋸1個(gè)小三角，然后用碘酊和酒精進(jìn)行消毒，接著在氣室的中央鉆一小孔，輕輕挑開殼膜，在刺破的地方滴加生理鹽水，將橡皮乳頭放在氣室的中間吸氣，使氣室內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，此時(shí)絨毛尿囊膜會(huì)下陷，從而形成人工氣室，緊接著接種樣品于絨毛尿囊膜上，并用蓋玻片蓋于卵窗上，最后用石蠟將其密封。雞胚接種完后，需橫放于保溫箱中，且嚴(yán)禁翻動(dòng)，并使卵窗方位保持向上。接下來，每天用照蛋器檢卵1次，若24 h內(nèi)死亡，則將其廢棄。廢棄的雞胚收取后，需放置在4℃冰箱內(nèi)，然后在無菌條件下打開雞胚氣室，將尿囊液和絨毛尿囊膜收取，接著放入無菌的青霉素瓶?jī)?nèi)，置于-20℃冰箱等待進(jìn)一步鑒定，同時(shí)觀察雞胚的病變情況。

1.4 病毒鑒定采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）進(jìn)行IBDV抗原鑒定。

1.4.1 抗原制備取具有典型病變的法氏囊組織或收獲的雞胚絨毛尿囊膜，剪碎、研磨，以PBS液稀釋成1∶5的乳劑，-20℃反復(fù)凍融3次，經(jīng)2 500 r/min離心沉淀后，取上清液，置低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 瓊脂板的制備在正式試驗(yàn)24 h前制備瓊脂板，將瓊脂1 g、氯化鈉8 g加入到100 mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.0～7.2后，水浴溶化。然后將充分溶化的瓊脂倒入平皿中，瓊脂板厚度約3 mm，冷卻后放入冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)用打孔器在瓊脂板上打7個(gè)孔，其中中間1個(gè)孔，孔徑為3 mm，外周6個(gè)孔，孔徑均為3 mm，孔距3 mm，見圖1。

圖1 瓊脂板示意圖

首先，中央的7號(hào)孔用已知的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清加滿；其次，將標(biāo)準(zhǔn)抗原加入到1、4號(hào)孔內(nèi)；接著在2、3號(hào)孔內(nèi)加入處理好的病死雞法氏囊組織樣品；最后在5、6號(hào)孔內(nèi)加入精處理的接種病料樣品后死亡雞胚的絨毛尿囊膜樣品，每孔加滿為止，放置濕盒內(nèi)，于37℃反應(yīng)24 h后觀察，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果經(jīng)剖檢，送檢的5羽病死雞呈現(xiàn)典型的雞傳染性法氏囊病的病變特征。病死雞表現(xiàn)出腺胃和肌胃的交界處有條狀出血癥狀，肌肉脫水，胸部、腿部的肌肉有出血狀，同時(shí)黏膜皺褶上也有出血點(diǎn)（斑），法氏囊水腫，腎臟腫大明顯且有尿酸鹽沉積。見圖1（a、b、c）。

2.2 雞胚接種結(jié)果5枚接種雞胚均于接種后48～96 h死亡，死亡胚病變特征為體表和皮下出血，胚水腫，腎臟出血，肝臟有壞死灶，心肌蒼白。

圖2 送檢病死雞的剖檢病變

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)抗原孔與標(biāo)準(zhǔn)血清孔之間形成1條明顯的、致密的白色沉淀線，法氏囊樣品孔、絨毛尿囊膜樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)血清孔間均出現(xiàn)明顯的沉淀線，根據(jù)以上試驗(yàn)，結(jié)果判定為陽性。

3 討論

1）在問診中了解到，該養(yǎng)雞戶為圖省事一直對(duì)雛雞采用飲水免疫的方法進(jìn)行雞傳染性法氏囊病免疫，因?yàn)槭艿侥冈纯贵w的影響，使受免疫的雞群產(chǎn)生的抗體水平不高甚至較低，且不均勻，造成雞群發(fā)病。同時(shí)還了解到該養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)管理粗放，育雛溫度低，飼養(yǎng)密度大，雞舍潮濕，通風(fēng)不良，衛(wèi)生條件差，飼料中蛋白質(zhì)水平過低，微量元素和維生素缺乏等，這些都可能是誘發(fā)病變的原因。所以，養(yǎng)雞戶應(yīng)全面實(shí)行科學(xué)的飼養(yǎng)管理。經(jīng)常清除糞便，勤換墊料，搞好雞舍的環(huán)境衛(wèi)生并定期進(jìn)行消毒，保證雞群健康生長(zhǎng)和具有良好的抗病能力。

2）免疫接種對(duì)雞傳染性法氏囊病的防治有顯著效果，然而在選擇疫苗時(shí)必須根據(jù)當(dāng)?shù)氐腎BD疫情選擇疫苗。該養(yǎng)殖戶因盲目跟從其他地方對(duì)疫苗的選擇而沒有考慮到當(dāng)?shù)貙?shí)際的疫情，導(dǎo)致免疫失敗。所以，在實(shí)際生產(chǎn)中必須根據(jù)自身的情況制定一套免疫程序。一般情況如下：對(duì)14～16日齡雛雞可用中等毒力弱毒疫苗（如CH80）進(jìn)行免疫，1次即可；對(duì)受IBDV污染較嚴(yán)重的雞場(chǎng)或母源抗體不均勻的雞場(chǎng)，可用活苗分2次進(jìn)行免疫，首次免疫為10～12日齡，第2次免為16～18日齡，接種疫苗可以選擇中強(qiáng)毒苗（如法貝靈）；對(duì)受IBDV污染尤其嚴(yán)重的雞場(chǎng)可使用組織滅活苗進(jìn)行免疫，免疫可選擇在7～10日齡進(jìn)行，這樣雞群就能產(chǎn)生抗體，得到較好的保護(hù)。其次種雞還應(yīng)選擇在以下2個(gè)時(shí)間段進(jìn)行滅活苗注射，分別是18～20周齡和40～42周齡，以便更好地提高雛雞的母源抗體水平。

Laboratory diagnosis to a case of infectious bursal disease

Liang Xiaojun
(Fujian Nanjing County Livestock Technology Service Station,363600)

Suspensions of tissues(20%w/v)were prepared in sterile phosphate buffered saline(PBS)added with sutiable antibiotics. The suspensions were clarified by low-speed centrifugation and 0.2 mL samples were inoculated into the chorioallantoic membrane of 10-day-old embryos.Eggs were candled daily for 5 days with mortality within the first 24 hours being considered nonspecific.Death of embryos occurred between 48～96 h post inoculation and showed specific features of IBDV infection.The samples of bursa collected from dead chicks and chorioallantoic membrane harvested from dead embryos were prepared for Agar gel immunodiffusion test.The results showed that there were clear white sediment lines between samples and standard antisera.According to the above results,the case could be determined as Infectious bursal disease.

Chick Infectious bursal disease Laboratory diagnosis

A

1003-4331（2015）06-0016-02