Plackett—Burman試驗(yàn)、最速上升試驗(yàn)及Box—Behnken試驗(yàn)聯(lián)用優(yōu)化梔子多酚超聲提取工藝

黃瀟　肖雄　高文軍　陳瑤

[摘要] 目的 優(yōu)化梔子多酚超聲提取工藝。 方法 通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)從乙醇濃度、粒徑、液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、提取次數(shù)幾個(gè)影響因素中挑選出顯著因素，然后針對(duì)顯著因素采用最速上升試驗(yàn)確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)，最終利用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化梔子多酚超聲提取工藝。 結(jié)果 最佳提取工藝為乙醇濃度45%，液料比25：1，提取時(shí)間35min，梔子總多酚得率為1.857%，與預(yù)測(cè)值1.9%接近。結(jié)論 優(yōu)化工藝科學(xué)合理，為梔子的開(kāi)發(fā)提供了參考。

[關(guān)鍵詞] 梔子；多酚；Plackett-Burman試驗(yàn)；最速上升試驗(yàn)；Box-Behnken試驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）19-61-05

[Abstract] Objective To optimize the ultrasonic extraction process of polyphenols from Gardenia jasminoides Ellis. Methods The significant factors were selected from the influence factors of concentration of ethanol， particle diameter、the ratio of liquid to material， ultrasonic power， ultrasonic temperature， ultrasonic time and extraction times by Placket-Burman experiment， then the central point of response surface was determined by the Steepest ascent experiment， finally the ultrasonic extraction process was optimized by Box-Behnken experiment. Results Optimum ultrasonic extraction process was as follows： concentration of ethanol 45%， the ratio of liquid to material 25：1， ultrasonic time 35min， the total yield of polyphenol was 1.857%， close to the predicted value of 1.9%. Conclusion The optimized extraction technology which provided references for the exploitation and utilization of Gardenia jasminoides Ellis was scientific and reasonable.

[Key words] Gardenia jasminoides Ellis； Polyphenol； Plackett-Burman experiment； Steepest ascent experiment； Box-Behnken experiment

梔子為常用中藥，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，歷代主要本草著作中均有收錄。國(guó)內(nèi)外從19世紀(jì)末開(kāi)始對(duì)梔子屬植物進(jìn)行大量化學(xué)成分方面的研究[1-5]，目前為止，從梔子中發(fā)現(xiàn)了大量的多酚類化合物。多酚類化合物是一類復(fù)雜的具有多個(gè)酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化性[6]、清除自由基、降血脂、降血壓、降血糖[7-8]、抗腫瘤[9-10]、抗衰老、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[11]。

近年來(lái)，響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥提取工藝、中藥制劑工藝、中藥處方篩選中已有大量應(yīng)用[12]，而Placket-Burman試驗(yàn)可從大量影響因子中篩選出顯著因子，最速上升試驗(yàn)又可將顯著因子最大程度逼近中心點(diǎn)，故此在優(yōu)選響應(yīng)面顯著因子方面最為準(zhǔn)確有效[13]。本研究利用Placket-Burman試驗(yàn)篩選出乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間三個(gè)顯著因素、采用最速上升試驗(yàn)確定響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)，最終通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)響應(yīng)面分析，優(yōu)化了梔子總多酚的超聲提取的工藝，為梔子的開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子（江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)范崔生教授鑒定為梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的果實(shí)，烘干，粉碎，過(guò)篩，備用。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110813-201204），95%乙醇、85%濃磷酸、37%濃鹽酸（汕頭市西朧化工有限公司），無(wú)水碳酸鈉、硫酸鋰、溴水（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），鉬酸鈉、鎢酸納（天津市化學(xué)試劑四廠）所有試劑均為分析純。Folin-Ciocalten（FC）試劑：參照文獻(xiàn)[14]自配。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

KQ-300超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），0412-CENTRIRIFUGE離心機(jī)（上海方術(shù)器械廠），BS224S電子天平（北京塞多利器有限公司），YF-116搖擺式粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司），UV-2100紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用80%乙醇定容至100mL容量瓶。分別移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于10mL容量瓶，加水至4.0mL后，加入2mL FC試劑搖勻，靜置5min；再加入10%碳酸鈉溶液2mL，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以80%乙醇溶液作空白組，于波長(zhǎng)764nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.095X-0.103，相關(guān)系數(shù)R2=0.9980。endprint

1.3.2 梔子總多酚的測(cè)定方法[15] 精密稱取梔子粉末0.5g，在一定條件下超聲提取，定容至20mL，取一定量上清液于10mL容量瓶，加水至4.0mL，先加入2mL FC試劑，搖勻，靜置5min；再加入2mL 10%碳酸鈉溶液，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以試劑作空白組，測(cè)定其在波長(zhǎng)764nm處的吸光度，通過(guò)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)樣品的濃度，按下式計(jì)算梔子總多酚含量，每組試驗(yàn)平行3次。

總多酚含量（%）=提取出的多酚類化合物量/梔子量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)

PB試驗(yàn)是一種通過(guò)N次試驗(yàn)可以研究最多K=N-1個(gè)變量（N一般為4的倍數(shù)）的兩水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能夠通過(guò)比較各因素兩水平的差異與整體的差異來(lái)確定其顯著性，從而達(dá)到篩選顯著因素的目的，可以避免在之后的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因素太多或部分因素不顯著而造成的試驗(yàn)成本浪費(fèi)[16-17]。

考察梔子總多酚超聲提取的7個(gè)影響因素，各因素以及水平的選擇來(lái)源于單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)：X1為乙醇濃度、X2為粒徑、X3為液料比、X4為超聲功率、X5為提取溫度，X6 為提取時(shí)間，X7為提取次數(shù)，X8為虛構(gòu)變量用以估算誤差。每個(gè)因素分別選取高水平（1）和低水平（-1），以梔子總多酚提取率為響應(yīng)值，用Design-Expert.8.05b軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平編碼見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

Design-Expert.8.05b軟件擬合出多項(xiàng)式方程如下：

Y=-1.41+1.6×10-2X1-9.2×10-2X2+1.6×10-2 X3+3.5×10-3X4+2.9×10-3X5+1.3×10-2 X6+2.6×10-2 X7

由表3可以看出，模型R2=0.9788，表明有97.88%試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異可用該模型解釋。R2adj=0.9418與R2接近，能夠更好的看出模型的解釋力。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響由P值決定，P<0.05時(shí)，該因素對(duì)總多酚的提取為顯著因素，反之不顯著。表3及擬合多項(xiàng)式可以看出，乙醇濃度X1、料液比X3、提取時(shí)間X6為顯著因素，對(duì)提取率的影響均為正相關(guān)，顯著程度為X3>X1>X6。

2.2 最速上升試驗(yàn)

最速上升試驗(yàn)，又叫最陡爬坡試驗(yàn)，能夠快速的將各因素水平趨近最優(yōu)響應(yīng)值，最終建立有效的響應(yīng)面擬合方程[18]。根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行最速上升試驗(yàn)。由PB試驗(yàn)結(jié)果可知，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)梔子總多酚得率有顯著影響，因此按這三個(gè)因素效應(yīng)的大小比例設(shè)定最速上升路徑和步長(zhǎng)。乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間的均為正相關(guān)，三因素的水平均為遞增，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，梔子多酚得率最大值在試驗(yàn)4附近，因此選擇試驗(yàn)4中各參數(shù)值為后續(xù)Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)法，將乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間三因素取三水平，編碼及水平見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

表7中，P<0.05表明模型或考察的因素有顯著影響。模型的P<0.0001，表明模型顯著性很高；模型失擬項(xiàng)P值為0.1097，大于0.05，表示失擬項(xiàng)不顯著；模型的R2=0.9971，R2adj=0.9934，表明模型的相關(guān)性和解釋度都很好。表7的結(jié)果中，由P值大小來(lái)判斷，乙醇濃度A、料液比B、提取時(shí)間C三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的大小影響為B>A>C，同時(shí)AC、A2、B2、C2的P值均<0.05，對(duì)響應(yīng)值有顯著影響。

圖1為Design-Expert.8.05b軟件擬合的二次回歸響應(yīng)面3D圖，結(jié)合表7結(jié)果可以看出乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，PAC>PAB>PBC，響應(yīng)值存在極值，經(jīng)Design-Expert.8.05b進(jìn)一步計(jì)算得出：當(dāng)乙醇濃度為44.53%，液料比25.26mL/g，提取時(shí)間為35.28min時(shí)，梔子總多酚提取率有最大值，為1.9%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，依據(jù)實(shí)際情況，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度45%，液料比25mL/g，提取時(shí)間為35min，平行試驗(yàn)3次，取平均值，得到實(shí)際提取率為1.857%，與預(yù)測(cè)值1.9%接近，表明采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化的梔子總多酚超聲提取模型準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本研究采用PB試驗(yàn)法、最速上升試驗(yàn)法、和Box-Behnken試驗(yàn)法，確定影響梔子總多酚超聲提取率3個(gè)顯著因素為乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間，在最佳工藝條件：乙醇濃度為44.53%，液料比25.26mL/g，提取時(shí)間為35.28min下，梔子總多酚得率預(yù)測(cè)值為1.9%。依據(jù)實(shí)際情況將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度45%，液料比25mL/g，提取時(shí)間為35min，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，此條件下梔子總多酚得率為1.857%，與預(yù)測(cè)值1.9%接近，表明了響應(yīng)面模型的可靠性和準(zhǔn)確定性，為梔子做為天然抗氧化劑來(lái)源的開(kāi)發(fā)和利用提供了參考。

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（收稿日期：2015-08-23）endprint