代謝組學(xué)在肝臟疾病研究中的應(yīng)用*

羅小芳，茹清靜

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310005）

代謝組學(xué)是一種新型的、整體性的分析技術(shù)，即應(yīng)用現(xiàn)代分析儀器，對(duì)生物體體液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性與定量的分析研究，獲得特征性的代謝標(biāo)志物，從而揭示生物體在某一特定環(huán)境下的基因調(diào)控功能。肝臟是機(jī)體代謝的樞紐，承當(dāng)了機(jī)體大部分的合成、分解和轉(zhuǎn)化等代謝過(guò)程。故從代謝的角度研究肝臟和肝臟疾病很重要。

1 代謝組學(xué)的概況

1.1 代謝組學(xué)的概念和特點(diǎn)

代謝組學(xué)是晚近興起的后基因組學(xué)，是生命科學(xué)最熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一。代謝組學(xué)（Metabonomics）的概念，由英國(guó)倫敦大學(xué)Nicholson 博士在1999 年首次提出，它被定義為代謝物質(zhì)動(dòng)態(tài)響應(yīng)的定量測(cè)定和定性分析，如病理生理、遺傳修飾的生物體和外界的刺激導(dǎo)致的改變等[1]。2000 年，德國(guó)馬普所的Fiehn 教授[2]等提出了metabolomics 的概念，將代謝組學(xué)界說(shuō)為一個(gè)靜態(tài)的過(guò)程，即對(duì)生物樣品的整體代謝譜研究是在特定條件下進(jìn)行的。近年來(lái)，隨著探究的深入，科學(xué)家們對(duì)其概念也進(jìn)行了完善和增補(bǔ)，將代謝組學(xué)定義為：通過(guò)分析生物體的體液、組織中內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化，獲取生物標(biāo)記物，從而揭示不同時(shí)間與環(huán)境下的生物體整體功能狀態(tài)的差異[3]。

代謝組學(xué)來(lái)源于代謝組[4]，是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模整合為目標(biāo)，通過(guò)對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)物在時(shí)間上的定量和定性分析，從總體上評(píng)價(jià)生命體的功能狀況及其改變[5]。與其他組學(xué)相比較，基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的有效微細(xì)變化會(huì)在代謝產(chǎn)物上得到放大，便于檢測(cè)，代謝物含量的微細(xì)變化與生物表型的大改變是可以有直接相關(guān)性的[6]，如Billy David 曾言：“基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么?！盵7]

1.2 代謝組學(xué)的研究方法

代謝組學(xué)的研究程序一般包括生物樣本的采集，樣品預(yù)處理，數(shù)據(jù)的收集、剖析與詮釋?zhuān)?hào)識(shí)別和路徑分析等環(huán)節(jié)[8]。關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是數(shù)據(jù)的分析和處理[9]，常用的方法是核磁共振（NMR），質(zhì)譜（MS）及其聯(lián)用技術(shù)：①NMR 技術(shù)，作為結(jié)構(gòu)分析的有力工具，它可以快速無(wú)創(chuàng)、無(wú)偏向性地對(duì)生物體液等復(fù)雜混合物進(jìn)行檢測(cè)，樣品不需要繁瑣處理，多種成分測(cè)定可同步進(jìn)行[10]。NMR 的局限性在于其靈敏度相對(duì)較低，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限，故不適合用于分析數(shù)量較大的低濃度代謝物。②MS 技術(shù)[11]，單獨(dú)運(yùn)用時(shí)速度較快，與其他技術(shù)聯(lián)合使用則具有高靈敏度、高選擇性、可定性定量分析多種代謝物等性質(zhì)，現(xiàn)已經(jīng)成為代謝組學(xué)研究中的首選技術(shù)。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[12]，能同時(shí)測(cè)定上千種不同化合物的化學(xué)性質(zhì)，具有較高的檢測(cè)靈敏度，我們還能參考其提供的質(zhì)譜庫(kù)來(lái)確定待分析樣品的代謝成分。最大的好處是，不需要那些非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的化學(xué)衍生化過(guò)程尤其適用于那些物質(zhì)熱穩(wěn)定性差，難揮發(fā)和相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)；毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS）[13]，這是一個(gè)相對(duì)較新且具有發(fā)展前景的技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于高分離效率和微量樣本量，故可以同時(shí)得到不同類(lèi)代謝物的不同的代謝組學(xué)特征。

2 代謝組學(xué)在肝臟疾病研究中的應(yīng)用

作為機(jī)體代謝的重要器官，肝臟承擔(dān)了大部分的合成、分解和轉(zhuǎn)化等過(guò)程，一些酶和功能是肝臟所特有的；肝臟一旦受損，將影響全身各個(gè)系統(tǒng)器官的功能，因此從代謝的角度研究肝臟疾病，有其物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。故在肝臟疾病研究中具有不可或缺的作用。

2.1 代謝組學(xué)在乙型肝炎中的應(yīng)用

全球人口中約有20 億人感染乙型肝炎病毒，其中20%～35%的患者最終將死于肝硬化或肝癌[15]。楊永霞等[16]利用超導(dǎo)核磁共振譜儀分別檢測(cè)8 例正常人血清和11 例重型乙型肝炎患者血清，發(fā)現(xiàn)重癥肝患者的蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖含量升高，而乳酸、膽堿和脂質(zhì)的含量降低。這些血清代謝物的差異可以幫助我們對(duì)重癥乙肝患者的早期識(shí)別、診斷及治療，提高預(yù)后生存率。侯麗娟等[17]采用NMR技術(shù)檢測(cè)慢性乙肝合并抑郁患者的尿液中的代謝物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)慢乙肝合并抑郁的患者尿液中乙酸鹽、馬尿酸鹽和二甲基甘氨酸的含量顯著升高，本研究結(jié)果有助于未來(lái)解決臨床實(shí)踐中抑郁癥診斷不確定的困境。

2.2 代謝組學(xué)在脂肪肝中的應(yīng)用

非酒精性脂肪肝是一種與肥胖、胰島素抵抗及遺傳因素有關(guān)的代謝性疾病[18]，是隱源性肝硬化的最主要病因[19]，70%隱源性肝硬化由非酒精性肝炎導(dǎo)致[20]，肝活檢是其臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于是一種有創(chuàng)技術(shù)，故臨床推廣受限。劉曉琳等[21]通過(guò)液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在大鼠的肝臟和血清中檢測(cè)差異表達(dá)的代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 只大鼠都出現(xiàn)了代謝紊亂，且硬脂酰肉毒堿在非酒精性脂肪肝的不同表型中都穩(wěn)定升高，為臨床提供了一個(gè)敏感且無(wú)創(chuàng)的診斷脂肪肝的方法。酒精性肝病[22]（Alcoholic liver disease，ALD）是由于酒精直接對(duì)肝臟細(xì)胞造成損害，引起肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、壞死，孫長(zhǎng)海等[23]用GC-MS 梁琦等[25]結(jié)合代謝組學(xué)結(jié)果檢測(cè)：確定了肌酐、氨基酸和谷胱甘肽等7 種可早期診斷酒精性肝病患者的尿液中生物標(biāo)記物。

2.3 代謝組學(xué)在肝損傷中的應(yīng)用

肝損藥物及其代謝產(chǎn)物的毒性作用、化學(xué)品及過(guò)敏反應(yīng)等非病毒性因素是造成肝損傷的主要原因[24]，而臨床上對(duì)肝損傷的診斷目前主要依靠排除法。廣防己、漢防己的使用會(huì)影響涉及葡萄糖和脂質(zhì)代謝的肝毒性和肝線粒體功能的影響；且涉及到能量代謝紊亂。Schoonen W[26]等發(fā)現(xiàn)用溴苯誘導(dǎo)肝壞死的小鼠模型，其肝壞死的程度與溴苯的劑量成正相關(guān)，處理組小鼠的血清及尿液中的乳酸鹽、酪氨酸等代謝產(chǎn)物的含量與對(duì)照組小鼠不同，提示我們可以通過(guò)檢測(cè)代謝產(chǎn)物的改變來(lái)發(fā)現(xiàn)具有特異性生物學(xué)標(biāo)記物的肝損傷。

2.4 代謝組學(xué)在肝硬化中的應(yīng)用

肝硬化是由一個(gè)或多個(gè)病因長(zhǎng)期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害，目前代謝組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于肝硬化的診斷[27]。楊永霞等[28]等用核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)磷酸膽堿/脂和膽堿含量降低，而乳酸、甲硫氨酸及葡萄糖的含量升高，這些代謝產(chǎn)物的差異提供了肝硬化在可靠的分子水平上的診斷依據(jù)，可盡早區(qū)分出乙肝和乙肝后肝硬化患者，便于及時(shí)進(jìn)行治療。

2.5 代謝組學(xué)在肝衰竭中的應(yīng)用

肝衰竭[29]是由多種因素引起的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒和排泄等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙甚至失代償，病死率極高。Yang 等[30]研究肝功能衰竭鼠模型的代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)肝功能衰竭組與對(duì)照組之間的血清膽汁酸峰值有明顯差異，提示血清膽汁酸水平可以為肝衰竭的病因分析及進(jìn)一步研究提供依據(jù)。Feng 等[31]應(yīng)用CG-MS 研究了急性肝功能衰竭大鼠的血清代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)血清中β-羥丁酸鹽、5-羥吲哚乙酸和磷酸鹽含量水平均增高，提示代謝產(chǎn)物的變化能幫助急性肝功能衰竭的診斷。

2.6 代謝組學(xué)在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）目前發(fā)病率位居惡性腫瘤第5 位，病死率居第3 位[32]，同時(shí)它的5 年生存率還不到7%[33]。甲胎蛋白（AFP）不是原發(fā)性肝癌獨(dú)有的客觀輔助指標(biāo)，鑒于AFP 的非特異性，張蕾等[34]選擇27 例肝癌患者、31 例肝硬化患者及22 例健康志愿者的尿液樣本，采用超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)的分析研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四氫醛固酮3 葡萄糖甘酸、膽汁甘氨酸等代謝物在肝癌組尿液中含量高于肝硬化組，而鵝脫氧膽酸、乳果糖、吡啶酚等代謝物的含量均低于肝硬化組，這些代謝標(biāo)志物的變化可以為原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)理及早期診斷提供重要的分子學(xué)依據(jù)。

2.7 代謝組學(xué)在肝移植中的應(yīng)用

肝移植是治療各種終末期肝臟疾病的主要手段。因?yàn)楦我浦残g(shù)前、術(shù)后患者易發(fā)生多器官的生理功能障礙和代謝代謝紊亂，故及時(shí)準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)病情變化，是患者能否實(shí)施肝移植和評(píng)估移植肝功能狀態(tài)的關(guān)鍵。有相關(guān)肝移植的研究[35]表明，許多重要的生物標(biāo)記物都與尿素代謝循環(huán)有關(guān)，如供肝者肝中甲基化精氨酸衍生物的濃度可以靈敏地預(yù)測(cè)移植肝的功能狀態(tài)，而血清和尿液中的尿素異常降低、谷氨酰胺異常升高的水平均可以用來(lái)判斷是否出現(xiàn)肝移植腎功能異常及急性排異反應(yīng)。

3 小結(jié)與展望

代謝組學(xué)技術(shù)正處于快速發(fā)展的階段，能全面評(píng)估細(xì)胞在其自身微環(huán)境中的狀態(tài)，具有巨大的應(yīng)用潛力和科學(xué)價(jià)值，其在肝臟疾病中的應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛。我們有理由相信，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步革新及分析技術(shù)的不斷完善，我們能尋找出更多特征性代謝標(biāo)志物，從而為其發(fā)病機(jī)理、診斷治療提供新的客觀依據(jù)。

[1] Nicholson JK，Lindon JC，Homlmes E. Metabolomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimulate via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[2] Fiehn O，Kopka J，Dormann P，et al. Metabolite profiling for plant functional genomics[J]. Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.

[3] 王斯婷，李曉娜，王皎，等. 代謝組學(xué)及其分析技術(shù)[J]. 藥物分析雜志，2010，30（9）：1792-1795.

[4] Sweetlove LJ，F(xiàn)ernie AR. Regulation of metabolic networks：understanding metabolic complexity in the systems biology era[J]. New Phytol，2005，168（1）：9-21.

[5] Liu CX，Li C，Lin DH，et al. Significance of Metabolomics in drug discovery and development [J]. Asian J Drug Metab Pharmacokinet，2004，4（12）：87.

[6] Nobeli I，Thornton JM. A bioinformatician’s view of the metabolome[J]. Bioessays，2006，28（5）：534-545.

[7] German JB，Bauman DE，Burrin DG，et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century：building the roads to individualized health [J]. Nutr，2004，134 （10）：2729-2730.

[8] 許國(guó)旺，路鑫，楊勝利，等. 代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（6）：701-702.

[9] Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al. Metabolomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）153-157.

[10] Rooney OM，Troke J，Nicholson JK，et al. High-resolution diffusion and relaxation edited magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver tissue [J]. Magn Reson Med，2003，50（7）：925-927.

[11] 盧紅梅，梁逸曾. 代謝組學(xué)分析技術(shù)及數(shù)據(jù)處理技術(shù)[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（3）：326-332.

[12] 李灝，姜穎，賀福初，等. 代謝組學(xué)技術(shù)及其在臨床研究中的應(yīng)用[J]. 遺傳，2008，30（4）：391-392.

[13] Soga T，Ohashi Y，Ueno Y，et al. Joumal of Proteome Research[J]. J Proteome Res. 2003，2（5）：488-491.

[14] 劉歡，韓濤. 代謝組學(xué)及其在肝臟疾病研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 實(shí)用肝臟病雜志，2008，11（1）：60-61.

[15] EI-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma [J]. Gastroenterology，2012，142（6）：1264-1273.

[16] 楊永霞，陳書(shū)峰，陳阿麗，等. 重癥乙型肝炎患者血清代謝組研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志，2011，36（3）：220-222.

[17] 侯麗娟，許清玉，段樹(shù)鵬，等. 尿液代謝組學(xué)診斷乙肝患者的抑郁癥狀[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（11）：1647-1651.

[18] 李萌，吳濤，季光，等. 代謝組學(xué)在中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪肝研究中的應(yīng)用[J]. 世界華人消化雜志，2015，23（7）：1044-1045.

[19] Poonawala A，Nair SP，Thuluvath PJ，et al. Prevalence of obesity and diabetes in patients with cryptogenic cirrhosis：a case-control study[J].Hepatology，2000，32（5）：689-692.

[20] Caldwell SH，Oelsner DH，Iezzoni J，et a1. Cryptogenic cirrhosis：clinical characterization and risk factors for underlying disease[J]. Hepatology，1999，29（13）：664-669.

[21] 劉曉琳，明雅南，張靜怡，等. 非酒精性脂肪性肝病不同表型的代謝組學(xué)研究[J]. 肝臟，2015，20（2）：95-100.

[22] 周云飛，陳偉軍. 酒精性脂肪肝流行病學(xué)調(diào)查[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2001，17（9）：732-734.

[23] 孫長(zhǎng)海，陳百慧，王蒙，等. 酒精性肝病患者尿液代謝組學(xué)研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36（5）：44-45.

[24] 孔明，戴菁，孫旖，等. 藥物性肝損傷生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥雜志，2013，22（3）：290-293.

[25] 梁琦，倪誠(chéng)，顏賢忠，等. 廣防己、粉防己的肝腎毒性及代謝組學(xué)比較研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2010，35（21）：2882-2888.

[26] Schoonen W，Lioks C，Ploem JP，et al.Sensitivity of 1H NMR analysis of rat urine in relation to toxico-metabonomics.Part 1：Dose dependent toxic effects of bromobenzene and paracetamol[J].Toxicol Sci，2007，98（3）：272-283.

[27] 郭孜，王文玉，戴建玉，等. 乙肝后肝硬化證候的尿代謝組學(xué)研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（1）：1282-1286.

[28] 楊永霞，楊生義，梁敏鋒，等.乙肝后肝硬化患者血清代謝組的核磁共振[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（1）：99-101.

[29] XU Bin，WANG Hai long，WEI Kai hua，et al. Metabonomics analytical techniques and their applications in the study of serious and fatal diseases [J]. Journal of Instrumental Analysis，2006，25（5）：128-133.

[30] Yang L，Xiong A，He Y，et al. Bile acids metabonomlic study on the CCl4-and alpha-naphthylisothiocyanate—induced animal models：quantitative analysis of 22 bile acids by ultraperformance liquid chromatography -mass spectrometry[J]. Chem Res Toxicol，2008，21（12）：2280-2288.

[31] Feng B，Wu S，Lv F，et al. Metabolic profiling analysis of a D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced mouse model of fulminant hepatic failure[J]. J Proteme Res，2007，6（6）：2161-2168.

[32] El-Serag HB，Rudolph L. Hepatocellular carcinoma：Epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology，2007，132（7）：2557-2559.

[33] Kassahun WT，F(xiàn)angmann J，Harms J，et al. Liver resection and transplantation in the management of hepatocellular carcinoma：a review [J]. Exp Clin Transplant，2006，4（2）：549-558.

[34] 張蕾，范志娟，張磊，等. 肝細(xì)胞肝癌患者尿液代謝輪廓分析及潛在生物標(biāo)志物篩選[J]. 實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2012，4（2）：73-78.

[35] Martin-Sanz P，Olmedilla L，Dulin E，et al. Presence of methylated arginine derivatives in ortho topic human liver transplantation：relevance for liver function [J]. Liver Transpl，2003，9（1）：40-47.