響應(yīng)面法優(yōu)化醇提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛，彭太兵，符秋霞，郭姝瓊，劉喜情

（懷化學(xué)院1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化418008）

響應(yīng)面法優(yōu)化醇提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛1，2，彭太兵2，符秋霞2，郭姝瓊2，劉喜情2

（懷化學(xué)院1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化418008）

以地瓜藤中總黃酮的提取量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法，研究不同工藝條件對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，優(yōu)化乙醇提取地瓜藤中總黃酮的工藝條件，提高總黃酮得率.最佳工藝條件為，料液質(zhì)量體積比1：52 g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取前浸泡50 min，提取溫度75℃，提取時間43 min，地瓜藤中總黃酮的提取量為44.16 mg/g，相比水提時總黃酮提取量25.62mg/g，醇提具有時間短、提取效率高等優(yōu)勢.

地瓜藤；總黃酮；乙醇提取；響應(yīng)面法

地瓜藤味苦、性寒，主要分布于廣西、貴州、湖南等地，為苗族常用藥材，含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)、黃酮類化合物，具有清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫等作用［1］.

黃酮類化合物是一類具有2－苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，廣泛存在于植物體內(nèi)，是許多食品和中藥材的有效成分，有抗菌、抗病毒、降糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用［2－4］.

目前，從不同中藥材中提取總黃酮的報(bào)道很多，但是，對于地瓜藤中總黃酮的提取工藝研究尚為不多.本文以地瓜藤為研究材料，以乙醇為提取劑，研究提取過程中影響總黃酮提取量的幾個因素，通過單因素試驗(yàn)、Plackett－Burman（PB）試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）試驗(yàn)，得出乙醇提取地瓜藤中總黃酮的最佳工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地瓜藤種植于懷化學(xué)院生物園，干燥至恒重，粉碎備用；蘆丁購自北京德威鈉生物技術(shù)有限公司，色譜純；乙醇及其它藥品均為分析純.

FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；UV－2450紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地瓜藤中總黃酮提?。?］精確稱取2.00 g地瓜藤粉于200 mL燒杯，加入100 mL50%的乙醇溶液，室溫?cái)嚢杞?0 min，升溫至60℃攪拌提取50 min，冷卻，10 000 rpmin離心3 min，收集濾液于100 mL容量瓶，加50%的乙醇稀釋至刻度，得樣品液.

1.2.2 單因素試驗(yàn)依次優(yōu)化料液質(zhì)量體積比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取前浸泡時間、提取溫度、提取時間等參數(shù)［6，7］.

1.2.3 PB試驗(yàn)［8］在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取量為響應(yīng)值，采用Design－Expert 8.0.6［9］進(jìn)行二級水平（低水平“－1”，高水平“1”［10］）PB試驗(yàn)，優(yōu)化料液質(zhì)量體積比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取前浸泡時間（C）、提取溫度（D）、提取時間（E）5個因素，篩選出對總黃酮提取量影響顯著的因素［11］.PB試驗(yàn)因素水平如表1所示.

表1 PB試驗(yàn)因素水平

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，采用最陡爬坡試驗(yàn)確定影響總黃酮提取量的主要因素的宜變區(qū)域［12］.

1.2.5 CCD試驗(yàn)CCD試驗(yàn)可用來評價(jià)試驗(yàn)指標(biāo)與各因素之間一階、二階或交互作用的非線性關(guān)系［13］.在單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液質(zhì)量體積比（A），提取前浸泡時間（C），提取時間（E）3個對地瓜藤中總黃酮提取效果影響顯著的因素，采用Design－Expert 8.0.6進(jìn)行3因素5水平CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平如表2所示.

表2 CCD試驗(yàn)因素水平

1.3 分析檢測方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用分光光度法，以蘆丁質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A510nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為A＝4.5829c－0.0125，R2＝0.9991.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液質(zhì)量體積比對總黃酮提取量的影響按照地瓜藤中總黃酮的提取方法，考察不同料液質(zhì)量體積比對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同料液質(zhì)量體積比對地瓜藤中總黃酮提取量的影響

由圖1可以看出，地瓜藤與乙醇溶液的質(zhì)量體積比小于1：50 g/mL時，地瓜藤中總黃酮的提取量隨質(zhì)量體積比的增大而增大；質(zhì)量體積比超過1：50 g/mL后，總黃酮的提取量增長緩慢.這可能是由于質(zhì)量體積比為1：50 g/mL時，地瓜藤中總黃酮的溶出已趨于飽和，再增大地瓜藤與乙醇溶液的質(zhì)量體積比對總黃酮的溶出幫助不大，且過高的液相濃度將會大大提高生產(chǎn)成本和后續(xù)濃縮難度［14］.由此得出，地瓜藤與乙醇溶液的質(zhì)量體積比，宜選用1：50 g/mL.

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響按照地瓜藤中總黃酮的提取方法，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，如圖2.

由圖2可以看出，地瓜藤中總黃酮的提取量在選用40%乙醇作溶劑時最大，為37.8 mg/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，總黃酮的提取量反而快速下降，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過大，增加了地瓜藤中醇溶性、親脂性物質(zhì)的溶出，同時，也降低了總黃酮的提取量，且過高的液相濃度將會大大增加后續(xù)目標(biāo)物質(zhì)純化的難度.由此得出，乙醇的體積分?jǐn)?shù)宜選用40%.

2.1.3 提取前浸泡時間對總黃酮提取量的影響按照地瓜藤中總黃酮的提取方法，考察提取前浸泡不同時間對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，如圖3.

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對地瓜藤中總黃酮提取量的影響

圖3 提取前浸泡時間對總黃酮提取量的影響

由圖3可以看出，總黃酮提取量隨提取前乙醇浸泡時間的延長而稍有增加，但浸泡時間超過50 min后，總黃酮的提取量增長緩慢.這可能是由于地瓜藤在室溫條件下，用乙醇浸泡50 min時，總黃酮的溶出率趨于飽和［15］.由此得出，以保證提取效果為前提，為了縮短時間，可選用40%的乙醇浸泡50 min后再提取.

2.1.4 提取溫度對總黃酮提取量的影響按照地瓜藤中總黃酮的提取方法，考察不同提取溫度對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同提取溫度對總黃酮提取量的影響

由圖4可以看出，乙醇溶液溫度由40℃升高至75℃，總黃酮的提取量不斷增大，當(dāng)溫度為75℃時，總黃酮的提取量最大，達(dá)43.6 mg/g，這可能是因?yàn)殡S著乙醇溶液溫度的升高，分子熱運(yùn)動加快，提取量不斷增大［16，17］，但乙醇的沸點(diǎn)在常壓條件下為78℃，故溫度再上升不利于實(shí)驗(yàn)操作.由此得出，提取溫度宜選用75℃.

圖5 不同提取時間對總黃酮提取量的影響

2.1.5 提取時間對總黃酮提取量的影響按照地瓜藤中總黃酮的提取方法，考察不同提取時間對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，如圖5.

由圖5可以看出，乙醇提取時間由20 min延長至40min，總黃酮的提取量不斷增大，當(dāng)提取時間為40 min時，總黃酮的提取量達(dá)到最大，為44.1 mg/g，繼續(xù)延長提取時間，提取量迅速下降，這可能是由于提取時間過長，總黃酮在長時間高溫條件下結(jié)構(gòu)破壞、分解，且長時間高溫提取耗能大，雜質(zhì)溶出量大［16，17］.由此得出，乙醇提取時間宜選用40 min.

2.2 PB試驗(yàn)

按照PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共進(jìn)行12次試驗(yàn)，其中6個空白因素［18］，每個試驗(yàn)號重復(fù)3次，取均值.試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3.

表3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

用Minitab l7［19］對表3中結(jié)果進(jìn)行回歸模型方差分析，如表4.

表4 回歸模型方差分析

由表4可以看出，PB試驗(yàn)結(jié)果的回歸擬合方程P＝0.000＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

并且該回歸擬合方程的R2＝0.965，調(diào)整后的R2＝0.936，相關(guān)系數(shù)高，這說明此變異可以用模型來解釋.

PB試驗(yàn)結(jié)果擬合所得回歸擬合方程的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5.

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

由表5可以看出，影響地瓜藤中總黃酮提取量的主要因素為料液質(zhì)量體積比（A）、提取前浸泡時間（C）、提取溫度（D）、提取時間（E），且影響順序?yàn)榱弦嘿|(zhì)量體積比（A）＞提取溫度（D）＞提取時間（E）＞提取前浸泡時間（C）.回歸得到多元一次方程為：Y＝22.02＋7.63A＋1.83C＋4.45D－2.63E.

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

以試驗(yàn)值的變化方向?yàn)榕榔路较颍瑢α弦嘿|(zhì)量體積比（A）、提取前浸泡時間（C）、提取時間（E）進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn).根據(jù)表5中因素估計(jì)系數(shù)，確定A，C兩個因素為正效應(yīng)，應(yīng)依次增大，E因素為負(fù)因素，應(yīng)依次減小；根據(jù)各因素效應(yīng)值與比例確定變化步長［20］.

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果詳見表6.

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表6可以看出，隨著爬坡的進(jìn)行，Y值—總黃酮的提取量不斷增加；在處理3處達(dá)到最大，之后開始緩慢下降，這說明在點(diǎn)3對應(yīng)的條件下，地瓜藤中總黃酮提取量接近最優(yōu)，因此，可以選擇這一點(diǎn)作為CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn).

2.4 CCD試驗(yàn)

2.4.1 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果選取料液質(zhì)量體積比（A）、提取前浸泡時間（C）、提取時間（D）3個因素，做3因素5水平響應(yīng)面分析，設(shè)計(jì)共20個試驗(yàn)點(diǎn)，其中14個析因點(diǎn)，6個中心點(diǎn)（以最陡爬坡試驗(yàn)的最優(yōu)值為中心點(diǎn)［21］），設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表7.

表7 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.4.2 回歸模型方差分析利用Design expert 8.0.6對 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，并對其模型的系數(shù)顯著性進(jìn)行分析，如表8；對其模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表9.

表8 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

由表8可以看出，在一次項(xiàng)中，料液質(zhì)量體積比（A）對總黃酮的提取量的影響達(dá)到了顯著水平，在二次項(xiàng)中，料液質(zhì)量體積比（A）、提取時間（E）對總黃酮的提取量的影響都達(dá)到了顯著水平.回歸擬合后得到多元一次方程為：Y＝44.11＋0.82A＋0.15C＋0.29E－0.48A2－0.18C2－0.51E2.

表9 回歸方程方差分析結(jié)果

從表9可以看出，回歸方程的F＝4.77＞F0.01（9，5），P＝0.0114＜0.05，表明該回歸方程模型達(dá)到顯著水平.失擬檢驗(yàn)分析得失擬不顯著，表明該回歸方程模型無失擬因素存在，與實(shí)測值能較好地?cái)M合.

該回歸方程模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.8110，校正后R2為0.9145，這表明采用此方法進(jìn)行地瓜藤中總黃酮的提取，其91.45%的變異分布在方程中，僅8.55%的變異不能由該模型解釋.

Y值—總黃酮的提取量的變異系數(shù)為1.47，相對較低，這表明該試驗(yàn)的精確度高，可靠性強(qiáng)，操作可信.

綜上所述，該回歸方程給地瓜藤中總黃酮的乙醇浸提提供了一個合適的模型.

2.4.3 最佳工藝參數(shù)的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)通過Design expert8.0.6，得出乙醇浸提地瓜藤中總黃酮的優(yōu)化工藝條件為：地瓜藤與40%乙醇質(zhì)量體積比1：52 g/mL，常溫浸泡50min，升溫至75℃，提取43min，此時總黃酮的理論提取量為44.2 mg/g.為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化工藝條件提取地瓜藤中總黃酮，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，在此條件下，每g地瓜藤中總黃酮的平均提取量為44.16 mg/g，與預(yù)測值一致，這說明此模型方程與實(shí)際情況擬合良好，由響應(yīng)面法優(yōu)化所得乙醇浸提地瓜藤中總黃酮的工藝條件具有實(shí)際

參考價(jià)值.

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)、PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、CCD試驗(yàn)對乙醇浸提地瓜藤中總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出地瓜藤與40%乙醇質(zhì)量體積比1：52 g/mL，常溫浸泡50 min，升溫至75℃，提取43 min的工藝條件下，總黃酮提取量為44.16 mg/g，相比水提時總黃酮提取量為25.62 mg/g，醇提具有時間短、提取效率高等優(yōu)勢.

地瓜藤的開發(fā)進(jìn)度緩慢，已經(jīng)造成了大量資源浪費(fèi)，對于其中活性成分的深入研究，必定為地瓜藤的開發(fā)研究提取基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)和參考依據(jù).地瓜藤的廣泛開發(fā)應(yīng)用，前景廣闊，可大大推動地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益.

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Optim ization of Ethanol Extraction of Total Flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by Response Surface Methodology

XU Jun-fei1，2，PENG Tai-bin2，F(xiàn)U Qiu-xia2，GUO Shu-qiong2，LIU Xi-qing2
（1.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources；2.College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

The optimization of ethanol extraction conditions of total flavonoids in Ficus tikoua Bur.by response surface methodology is to improve the yield.Based on the single－factor test analysis，the Plackett－Burman experimental design and steepestascent design，while taking extracted amount of total flavonoids as the response value，response surface method was applied to analyze the influence of various factors and their interaction on the extraction of total flavonoids，an optimized progress was selected to extract total flavonoids in ficus tikoua Bur.The optimal ethanol extraction conditions of total flavonoids are solidliquid ratio 1：52（g/mL），ethanol concentration 40%，soak time 50 min，extraction temperature 75℃，extraction time 43 min.Under these conditions，total flavonoids yield reached 44.16 mg/g.

ficus tikoua bur.；total flavonoids；ethanol extraction；response surfacemethodology

Q657.3

A

1671－9743（2015）11－0001－06

2015－08－01

湖南省重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科經(jīng)費(fèi)資助（2011－42）.

徐君飛，1981年生，女，湖南邵陽人，講師，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工.