白楊素抑制H1299細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成

冷超，韋兵，莫靚，龍超眾，馮耀光，賀大璞，王元星

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

·論著·

白楊素抑制H1299細(xì)胞系肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成

冷超，韋兵，莫靚，龍超眾，馮耀光，賀大璞，王元星

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的觀察白楊素是否抑制人肺癌H1299細(xì)胞系干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成能力，并探討其作用機(jī)制是否涉及CK2α表達(dá)和Notch1信號(hào)。方法干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)與擴(kuò)增H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞作為肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。不同濃度白楊素處理，腫瘤球形成法檢測(cè)H1299球形成細(xì)胞的腫瘤球形成率；Western blot分析CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)。CK2α siRNA轉(zhuǎn)染探討白楊素作用機(jī)制。結(jié)果白楊素（5、10和20μM）處理H1299球形成細(xì)胞72 h，腫瘤球形成率以濃度依賴(lài)方式降低；CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)下調(diào)。CK2α siRNA轉(zhuǎn)染H1299球形成細(xì)胞導(dǎo)致Notch1信號(hào)抑制，并協(xié)同白楊素抑制腫瘤球形成。結(jié)論白楊素具有抑制肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成作用，其作用機(jī)制涉及下調(diào)CK2α表達(dá)抑制Notch1信號(hào)傳導(dǎo)。

肺癌；肺癌干細(xì)胞；白楊素；CK2α；Notch1

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為肺癌是一種干細(xì)胞疾病，干細(xì)胞自我更新性質(zhì)使其自我復(fù)制性生存并不斷增殖和分化，干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制紊亂導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和演進(jìn)[1]。有研究顯示，Notch信號(hào)參與肺發(fā)育，并有促癌作用[2]。此外，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44被證明是Notch信號(hào)下游靶基因，受Notch信號(hào)調(diào)控[3]，同時(shí)，Notch信號(hào)傳導(dǎo)和CD44調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新能力[3]。CK2α（蛋白激酶CK2催化亞基）在包括肺癌在內(nèi)的許多腫瘤中過(guò)表達(dá)[4]。ZHANG等[4]最近研究證明，CK2α抑制下調(diào)Notch1信號(hào)，并隨后降低人肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞群比例。

白楊素是一種在多種植物中廣泛存在的黃酮類(lèi)化合物，具有抑制CK2和抗腫瘤作用[5-6]。新近的研究提供證據(jù)表明，白楊素類(lèi)似物即8-溴-7-甲氧基白楊素具有逆轉(zhuǎn)宮頸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制肝癌干細(xì)胞自我更新作用[7]。本文檢測(cè)白楊素是否抑制人肺癌H1299細(xì)胞系干細(xì)胞樣細(xì)胞腫瘤球形成，并探討其作用機(jī)制是否涉及CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)下調(diào)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞系細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)上海市），細(xì)胞用添加10%熱滅活胎牛血清，青霉素（100μg/mL）和鏈霉素（100μg/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳CO2的37℃增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和擴(kuò)增。

1.2細(xì)胞成球培養(yǎng)

為了獲得H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞，用添加20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）（PeproTech公司）、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF）（PeproTech公司）、5μg/mL胰島素（Sigma-Aldrich公司）、0.4%牛血清清蛋白（BSA，Invitrogen公司）和0.02×B27添加物（Invitrogen公司）的無(wú)血清DMEM/F 12培養(yǎng)基接種于超低黏附6孔板懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞密度為105個(gè)/mL。每3天補(bǔ)充培養(yǎng)液1.0 mL。培養(yǎng)9 d，收集球形成細(xì)胞，分散成單細(xì)胞懸液并再懸浮于新鮮干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3腫瘤球形成率測(cè)定

為了測(cè)定白楊素（美國(guó)Sigma公司）對(duì)腫瘤球形成率的影響，細(xì)胞以1 000個(gè)/mL的密度接種于超低黏附24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。培養(yǎng)9 d，計(jì)數(shù)腫瘤

球數(shù)。腫瘤球形成率（%）=每孔腫瘤球均數(shù)/每孔接

種活細(xì)胞數(shù)（1000）×100%。

1.4siRNA轉(zhuǎn)染

CK2α siRNA與對(duì)照siRNA為美國(guó)Thermo Scientific公司（Waltham，MA）產(chǎn)品。按照廠商的說(shuō)明，使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體RNAiMAX（Invitrogen，Carlsbad，CA）用50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Western blot分析確證siRNA敲除效率。

1.5Western blot分析

參照文獻(xiàn)[7]的方法，用裂解緩沖液（50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2%NP-40、10%甘油、1 M β-Me、1μg/mL抑肽酶、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF和蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞。Bradford法測(cè)定蛋白含量。10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（PVDF）。用含5%脫脂牛奶PBST封閉PVDF膜，抗-CK2α（Millipore公司）、抗-活化型Notch1和抗-CD44（Cell Signaling，Beverly，MA）以及抗-β-actin（Sigma公司）抗體作為一抗，在4℃、輕微震動(dòng)條件下孵育PVDF膜過(guò)夜。然后，用過(guò)氧化物酶連接二抗孵育膜1 h，根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)的操作步驟，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光儀（Amersham Biosciences）檢測(cè)信號(hào)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。應(yīng)用SPSS 13.0 Windows軟件系統(tǒng)（SPSS Inc，Chicago，IL）分析所有數(shù)據(jù)。Student’st-檢驗(yàn)用于比較各組間的差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肺癌H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞具有自我更新特性

干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法結(jié)果顯示：H1299細(xì)胞系能形成非粘附性腫瘤球（圖1A），稱(chēng)為球形成細(xì)胞。球形成細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)果證明：分散的單個(gè)細(xì)胞能形成新腫瘤球，以第3代球細(xì)胞的腫瘤球形成率最高（圖1B）。提示：H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞具有自我更新能力。因此，在后續(xù)試驗(yàn)研究中，我們以H1299細(xì)胞系第3代球形成細(xì)胞作為肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞模型。

2.2白楊素有效減弱H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新能力

腫瘤球形成率檢測(cè)結(jié)果證實(shí)：ChR（5、10和20μM）處理H1299細(xì)胞系第3代球形成細(xì)胞72 h，腫瘤球形成率以濃度依賴(lài)降低（圖2）。說(shuō)明：ChR有效減弱H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新能力。

圖1 人肺腺癌H1299細(xì)胞系成球培養(yǎng)

圖2 白楊素對(duì)H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新的影響

2.3白楊素抑制H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)

Western blot分析結(jié)果表明：ChR濃度依賴(lài)性下調(diào)H1299球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)（圖3）。

圖3 白楊素對(duì)H1299球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)的影響

2.4CK2α沉默下調(diào)Notch1及其靶基因蛋白表達(dá)

Western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CK2α特異性siRNA轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞導(dǎo)致CK2α蛋白水平明顯下調(diào)（圖4，上泳道）；Notch1和CD44蛋白水平下降（圖4，中泳道和下泳道）。

圖4 CK2α siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和CD44表達(dá)的影響

圖5 CK2α siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合白楊素處理對(duì)H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和Gli1表達(dá)的影響

2.5CK2α抑制增強(qiáng)白楊素抑制Notch1及其靶基因蛋白表達(dá)作用

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比。CK2α siRNA轉(zhuǎn)染與10μM ChR合用導(dǎo)致H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步下降（圖5）。

2.6CK2α抑制協(xié)同白楊素降低腫瘤球形成率

腫瘤球形成法檢測(cè)結(jié)果表明：CK2α siRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)致H1299球形成細(xì)胞的腫瘤球形成率下降（圖6），并顯著增強(qiáng)ChR（10 μM）降低H1299球形成細(xì)胞腫瘤球形成率作用（圖6）。

圖6 CK2α siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合白楊素處理對(duì)H1299球形成細(xì)胞自我更新的影響

3 討論

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在人肺癌H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞，多功能蛋白激酶CK2為Notch1信號(hào)正性調(diào)節(jié)因子。其證據(jù)包括：首先，CK2α siRNA轉(zhuǎn)染抑制CK2α導(dǎo)致Notch1蛋白水平下降。其次，CK2α敲除引起Notch1信號(hào)靶基因（CD44）產(chǎn)物表達(dá)下調(diào)。第三，CK2α敲除導(dǎo)致人肺癌H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞的腫瘤球形成率降低。

已有研究報(bào)道稱(chēng)Notch1能被CK2在絲氨酸1901處磷酸化并且這種磷酸化負(fù)性調(diào)節(jié)Notch1轉(zhuǎn)錄活性[8]。CK2磷酸化Notch1第2個(gè)絲氨酸位點(diǎn)（S847）有可能增強(qiáng)Notch1蛋白穩(wěn)定性[8]。ZHANG等[4]通過(guò)CK2α siRNA處理后的蛋白降解試驗(yàn)證明，CK2α沉默縮短A549細(xì)胞Notch1蛋白半衰期；說(shuō)明這種CK2對(duì)Notch1的正性調(diào)節(jié)作用部分歸因于減少蛋白降解。然而，CK2正性調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)精確分子機(jī)制尚待深入研究。

已有研究報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞系，球形成細(xì)胞富集表達(dá)CD44干細(xì)胞樣細(xì)胞[9]。本文的研究結(jié)果亦證實(shí)，H1299球形成細(xì)胞具有自我更新特性，并高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44蛋白。特別值得注意的是，來(lái)源豐富的黃酮類(lèi)化合物白楊素顯著抑制H1299細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新能力，并與CK2α siRNA轉(zhuǎn)染協(xié)同性下調(diào)CK2α、Notch1和CD44蛋白表達(dá)。這些結(jié)果為應(yīng)用小分子CK2α抑制劑調(diào)控Notch信號(hào)靶向抑制肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性治療人非小細(xì)胞肺癌提供了合理性解釋。

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（王榮兵 編輯）

Inhibitory effects of chrysin on tumor sphere formation of lung cancer stem-like cells from H1299 cell line

Chao LENG,Bing WEI,Liang MO,Chao-zhong LONG,Yao-guang FENG, Da-pu HE,Yuan-xing WANG
(Department of Thoracic Cardiovascular Surgery,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To investigate whether Chrysin(ChR)inhibits the capacity of tumor sphere formation in lung cancer stem cell-like cells(LCSCLCs)derived from H1299 cell line and whether the mechanism underlying this action is associated with inhibition of CK2α expression and Notch1 signaling.【Methods】Sphere-forming cells (SFCs)from H1299 cell line which were suspended cultured with stem cell-conditioned medium were taken as LCSCLCs.H1299 SFCs were treated with various concentrations of ChR.Self-renewal capacity was detected by tumor sphere-forming assay.The expression of CK2α,Notch1 and CD44 was detected by Western blot analysis.The mechanism by which chrysin inhibits self-renew of H1299 SFCs was explored using CK2α siRNA transfection.【Results】After treatment with ChR(5,10 and 20 μM)for 72 h,the rate of tumor sphere-forming of H1299 SFCs was decreased in a concentration-dependent manner.CK2α siRNA transfection led to inhibition of Notch1 signal pathway in H1299 SFCs.CK2α siRNA transfection also can enhance the inhibitory effect of ChR on the capacity of tumor sphere-forming in LCSCLCs.【Conclusion】The inhibitory effect of ChR on tumor sphere-forming capacity of LCSLCs derived from H1299 cell line is associated with down-regulation of CK2α expression and inhibition of Notch1 signal pathway.

lung cancer;lung cancer stem cells;chrysin;CK2α;Notch1

R734.2

A

1005-8982（2015）25-0030-04

2015-03-16