聯(lián)合金雀異黃素和TRAIL處理對SMMC—7721肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的影響

李翀　唐純娜　賀更生

[摘要] 目的 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是其誘導(dǎo)促生存反應(yīng)導(dǎo)致耐藥。金雀異黃素抑制核因子-κB（NF-κB）活性。本文旨在探討金雀異黃素和TRAIL以及兩者合用誘導(dǎo)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的作用。 方法 干細(xì)胞條件培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞獲得第3代腫瘤球形成細(xì)胞，作為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。金雀異黃素（10 μM）、TRAIL（10 ng/mL）及兩者聯(lián)合處理肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞72 h；免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA）測定細(xì)胞組蛋白/DNA碎片；碘化丙啶（PI）染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 10 μM 金雀異黃素誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 152%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%]適度增高（P<0.05）；10 ng/mL TRAIL對肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 110%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]無明顯影響；10 μM 金雀異黃素預(yù)孵育1 h，聯(lián)合10 ng/mL TRAIL處理導(dǎo)致組蛋白/DNA碎片水平（100% vs 568%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%]顯著增高（P<0.05）。10 ng/mL TRAIL誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，10 μM 金雀異黃素抑制NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，聯(lián)合金雀異黃素與TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表達(dá)水平。 結(jié)論 金雀異黃素與TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡涉及NF-κB抑制。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；NF-κB

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）13-0023-03

[Abstract] Objective Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） has been demonstrated that selectively induced cancer cells， but facilitated prosurvival response leading to resistance. It has been reported that genistein could inhibit nuclear factor-κB（NF-κB） exprotein and activaty. The purpose of this study was to examine the effects of genistein or TRAIL， or both on apoptosis of liver cancer stem-like cells（LCSLCs） derived from SMMC-7721 cell line. Methods The third passage sphere-forming cells（SFCs） derived from SMMC-7721 cell line which was also called LCSLCs were obtained though suspended culture in ultra-low adhesion plate with stem cell-conditioned medium. LCSLCs were treated with Genistein（10 μM） and TRAIL（10 ng/mL） alone or in combination for 72 h. Histone/DNA fragment was tested using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. And apoptosis rate was detected by flow cytometry （FCM） with propidium iodide（PI） staining； the protein expression of NF-κB（p65） was analyzed by western blot. Results The level of histone/DNA fragment（100% vs 152.6%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%] was increased moderately by genistein（10 μM） in LCSLCs（P<0.05）， but TRAIL（10 ng/mL） has no effect on histone/DNA fragment level（100% vs 110%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]. After preincubation with 10μM genistein for 1h， the combination with 10 ng/mL TRAIL lead to significantly increase of histone/DNA fragment level（100% vs 568%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%] （P<0.05）. 10 ng/mL TRAIL induced NF-κB（p65） expression in LCSLCs. 10 μM genistein could suppress the protein expression of NF-κB（p65）. And the protein expression of NF-κB（p65） was significantly attenuated by the combination of genistein and TRAIL. Conclusion The apoptosis of LCSLCs which is co-induced by genistein and TRAIL is associated with the inhibition of NF-κB.

[Key words] Liver cancer； Cancer stem cell； Apoptosis； NF-κB

肝細(xì)胞癌位列癌癥相關(guān)死因第三位；其死亡率高主要是由于高復(fù)發(fā)率和耐藥性[1]。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤組織中存在化療抵抗的干細(xì)胞樣細(xì)胞群，在肝細(xì)胞癌中，肝癌干細(xì)胞能在化療后重新構(gòu)建腫瘤[2]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（tumor necrosis factor-related apoptosis ligand，TRAIL）已經(jīng)達(dá)到只針對惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞和不影響正常細(xì)胞和不損傷正常組織的治療結(jié)果。雖然Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明重組可溶性TRAIL有良好耐受性，但是其抗腫瘤活性有限[3]；此外，TRAIL信號(hào)并不總是導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。事實(shí)上一些研究表明，TRAIL可以通過某些信號(hào)分子包括核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Akt等因子誘導(dǎo)促生存反應(yīng)[3]。有研究顯示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞具有TRAIL抗性[4]。

金雀異黃素是大豆制品中的主要異黃酮。已有研究證明金雀異黃素在體內(nèi)外具有預(yù)防和治療包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤作用[5]。還有研究表明，金雀異黃素通過抑制NF-κB活性增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[6]。然而金雀異黃素是否能通過抑制NF-κB活性增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡仍然缺乏文獻(xiàn)資料。本文研究金雀異黃素和TRAIL以及兩者合用對人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的作用，并探討其作用機(jī)制是否涉及金雀異黃素抑制基礎(chǔ)和TRAIL誘導(dǎo)NF-κB活性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與試劑

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SMMC-7721自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）購得。SMMC-7721細(xì)胞系生長用添加10%胎牛血清、100 IU/mL盤尼西林、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基置5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

金雀異黃素和胰島素購自美國Sigma公司。重組人TRAIL購自美國R&D Systems 公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、50×B27添加物（不含維生素A）和胎牛血清購于美國Gibco公司。重組人表皮生長因子（EGF）和人堿性成纖維生長因子（bFGF）購于PROSPEC公司。鼠抗人NF-κB（p65）單克隆抗體購于美國Cell signaling公司；鼠抗人β-catenin單克隆抗體和辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz生物科技有限公司。

1.2腫瘤球培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[7]描述的方法，用無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基[含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1×B27和0.4 μg/mL胰島素的DMEM/F12（Gibco Invitrogen）培養(yǎng)基]懸浮，以5000細(xì)胞/孔的密度接種6孔超低粘附培養(yǎng)板。培養(yǎng)6 d，得到腫瘤球形成細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并計(jì)數(shù)。

1.3細(xì)胞凋亡檢測

按照文獻(xiàn)[8]描述的方法，用碘化丙啶熒光染色流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率以及酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平評(píng)估細(xì)胞凋亡程度。

1.4蛋白印跡分析

按照文獻(xiàn)[8]描述的方法進(jìn)行總細(xì)胞溶解產(chǎn)物的制備和蛋白印跡分析?？笵R5抗體、抗NF-κB（p65）抗體和抗β-actin抗體作為一抗。用增強(qiáng)型ECL蛋白質(zhì)印記分析系統(tǒng)檢測信號(hào)。

2結(jié)果

2.1肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增

干細(xì)胞條件培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞形成懸浮生長的腫瘤球（圖1）。腫瘤球傳代培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)：第3代球形成細(xì)胞的腫瘤球形成率最高（18.92±2.17）%，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞模型。

2.2金雀異黃素和TRAIL及兩者合用對肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平的影響

ELISA測定結(jié)果顯示：金雀異黃素（10 μM）處理導(dǎo)致肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平增高52%（P<0.05）；TRAIL（10 ng/mL）處理僅提高10%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；金雀異黃素（10 μM）與TRAIL（10 ng/mL）合用使組蛋白/DNA碎片水平增高468%，提示聯(lián)合金雀異黃素（10 μM）與TRAIL（10 ng/mL）協(xié)同性誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.3金雀異黃素和TRAIL及兩者合用對肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡率的影響

PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果證實(shí)：溶媒（0.1% DMSO）處理、金雀異黃素（10 μM）處理、TRAIL（10 ng/mL）處理以及聯(lián)合金雀異黃素（10 μM）和TRAIL（10 ng/mL）處理肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡率分別是（2.71±0.64）%、（5.14±0.76）%、（3.15±0.72）%和（17.3±1.27）%（圖3），說明聯(lián)合金雀異黃素與TRAIL協(xié)同性誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡。

2.4 聯(lián)合金雀異黃素與TRAIL下調(diào)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)

Western blot分析結(jié)果表明，10 ng/mL TRAIL誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，10 μM 金雀異黃素抑制NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，聯(lián)合金雀異黃素與TRAIL有效降低NF-κB（p65）蛋白表達(dá)水平（圖4）。

3討論

盡管TRAIL具有選擇性腫瘤細(xì)胞毒性，不影響非惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可作為一種很有前途的抗癌藥物[9]；但是，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRAIL（10 ng/mL）處理SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞即定義的肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其證據(jù)包括不能有效增高細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平和細(xì)胞凋亡率。這些結(jié)果提供了肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞具有TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡耐受性的證據(jù)。我們還證實(shí)TRAIL （10 ng/mL）處理誘導(dǎo)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，從而提示，肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡耐受性的可能機(jī)制之一是其誘導(dǎo)NF-κB所致。

雖然金雀異黃素（10 μM）只能輕微誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡，然而，當(dāng)使用金雀異黃素（10 μM）預(yù)孵育后聯(lián)合TRAIL（10 ng/mL）處理導(dǎo)致肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞組蛋白/DNA碎片水平和細(xì)胞凋亡率增高數(shù)倍。這些結(jié)果證明，聯(lián)合金雀異黃素和TRAIL可以引起協(xié)同性誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡作用，因此，有可能根除肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮治療人肝細(xì)胞癌作用。我們的結(jié)果顯示，金雀異黃素不僅能下調(diào)基礎(chǔ)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)，而且能有效抑制TRAIL誘導(dǎo)的NF-κB（p65）蛋白表達(dá)。這些結(jié)果啟迪我們，金雀異黃素可能通過抑制TRAIL誘導(dǎo)NF-κB（p65）蛋白表達(dá)即NF-κB活化增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡作用。因此，我們的研究結(jié)果為臨床應(yīng)用天然制劑金雀異黃素和選擇性腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL靶向腫瘤干細(xì)胞治療腫瘤特別是肝細(xì)胞癌提供了合理性的解釋。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yeh YC，Liu CJ，Kuo RN，et al. Association of adjuvant antiviral therapy with risk of cancer progression and deaths in patients with hepatitis-B-virus-related hepatocellular carcinoma following curative treatment：A nationwide cohort study[J]. Plos One，2014，9（7）：e102051.

[2] He G，Cao X，He M，et al. Casticin inhibits self-renewal of liver cancer stem cells from the MHCC97 cell line[J]. Oncol Lett，2014，7（6）：2023-2028.

[3] Stuckey DW，Shah K. TRAIL on trial： preclinical advances in cancer therapy[J]. Trends Mol Med，2013，19：685-694.

[4] Szegezdi E，OReilly A，Davy Y，et al. Stem cells are resistant to TRAIL receptor-mediated apoptosis[J]. J Cell Mol Med，2009，13：4409-4414.

[5] Ning YX，Li QX，Ren KQ，et al. 7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1[J]. Oncol Lett，2014，8（1）：295-300.

[6] Jin CY，Park C，Moon SK，et al. Genistein sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to TRAIL-mediated apoptosis by enhancing Bid cleavage[J]. Anticancer Drugs，2009，20（8）：713-722.

[7] Ren KQ，Cao XZ，Liu ZH，et al. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling[J]. Int J Oncol，2013，43（5）：1719-1729.

[8] Yang JF，Cao JG，Tian L，et al. 5，7-Dimethoxyflavone sensitizes TRAIL-induced apoptosis through DR5 upregulation in hepatocellular carcinoma cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（1）：195-206.

[9] Khanbolooki S，Nawrocki ST，Arumugam T，et al. Nuclear factor-kappaB maintains TRAIL resistance in human pancreatic cancer cells[J]. Mol Cancer Ther，2006，5（9）：2251-2260.

（收稿日期：2015-03-05）