miR-20b在腎癌中的表達分析及臨床意義研究

金露 李一帆 陳獨群 蘇鄭明 劉家駒 楊尚琪 桂耀庭 毛向明 來永慶

腎細胞癌又稱腎癌，約占成人惡性腫瘤的3%，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，也是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中致死率最高的腫瘤［1-2］。最近的腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在美國腎癌的發(fā)生率和死亡率均位于前十，僅2013年腎癌的新發(fā)病例就有65 150例，而且有8 780例死于腎癌［3］。腎癌發(fā)生的早期無相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，患者多在體檢或做其他疾病檢查時被發(fā)現(xiàn)，約30%的患者因遠處轉(zhuǎn)移癥狀而就診［4］。如果不予治療，腎細胞癌的5年生存率約為2%，生存時間的中位數(shù)約8個月［5］。目前腎癌的發(fā)生、發(fā)展機制尚不明確，臨床也尚未應(yīng)用一些生物標志物來診斷、治療腎癌或評估其預(yù)后。因此，以腎癌的發(fā)生機制為基礎(chǔ)來尋找可用于腎癌早期診斷或靶向治療、判斷預(yù)后的生物標志物是很有必要的。

微小RNA（MicroRNA／miRNA／miR）是一種短鏈非編碼RNA，約有22個核苷酸，miRNA能非特異性結(jié)合mRNA上的靶基因，通過使其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄來調(diào)控基因的表達［6-7］。研究表明，miRNA在多個細胞進程中均扮演著重要的角色，包括細胞的增殖、分化、新陳代謝和凋亡等［7-8］。截至目前，在大量人類的癌組織中都發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達或突變。據(jù)推測，超過60%的人類蛋白編碼基因都能和miRNA結(jié)合［9］。另外，miRNA在人血清中不容易被降解而且穩(wěn)定存在，容易被檢測，是良好的生物標記物［10-11］。為了探究miR-20b在腎癌中的作用機制，本研究以前期測序為基礎(chǔ)，對腎癌和癌旁組織中具有差異表達的miR-20b進行RT-qPCR驗證比較，分析miR-20b的表達量是否與患者臨床病理特點有關(guān)，為miR-20b在腎癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機制以及其在腎癌中的診斷價值等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究標本與臨床資料

本研究隨機選取42例深圳市重大疾病臨床資料和生物資源標本庫保存的腎癌及其配對的癌旁正常組織標本（2010年1月至2013年10月收集于安徽、北京、深圳等各大醫(yī)院，每例標本均為手術(shù)切除，且均得到就診醫(yī)院和北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，并獲得患者知情同意，簽署知情同意書）。每例標本包括經(jīng)病理切片證實的腎癌組織及配對的癌旁正常組織（取自根治性腎切除術(shù)距離癌組織＞5cm的正常腎組織，且經(jīng)病理證實無癌組織浸潤）各1份，患者均有完整的臨床病理資料（表1）。標本來源的腎癌患者包括女15例，男27例，平均年齡50.28（14～78）歲，中位年齡53歲。組織學(xué)分類采用WHO2004年腎細胞癌病理分類標準，臨床分期則采用2009年國際抗癌組織（UICC）／美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）臨床分期標準。

二、主要試劑和儀器

RNA 提取試劑 Trizol（Invitrogen，USA），microRNA 熒光試劑 miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany），microRNA 專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit（Qiagen，Germany），NanoDrop 2000c紫外分光光度計（Thermo Scientific，USA），普 通 RT-PCR 儀 （BIO-RAD，USA），LC 480 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，USA），常規(guī)試劑及儀器等由北京大學(xué)深圳醫(yī)院男性生殖與遺傳中心實驗室所提供。

三、miRNA的前期測序及篩選

本研究前期測序由深圳華大基因研究所采用Illumina Hiseq2000測序儀完成。通過第二代測序方法篩選在腎癌組織和癌旁配對正常組織中表達有差異的miRNAs。因目前在其他腫瘤組織中已經(jīng)有關(guān)于miR-20b作為促癌因素的報道，而腎癌組織中miR-20b表達下調(diào)，提示其在腎癌發(fā)生發(fā)展中有著不同的作用機制，因此本研究選用差異表達的miR-20b［log2（T／N）＝-0.89，P＝0.030 3］作為研究對象進行進一步的研究及探討。

四、總RNA的提取

將選取的42例標本在液氮下碾磨后，按照說明書使用Trizol試劑提取碾磨后標本中的總RNA，之后測定提取得到的總RNA濃度（使用NanoDrop 2000c紫外分光光度計測定）。

五、總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù) miScript Reverse Transcription Kit說明書所述，在反應(yīng)體系中加入1μg總RNA，在普通PCR儀上進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37℃60min，95℃5min。合成的cDNA置于-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

六、RT-qPCR檢測miR-20b

根據(jù) miScript SYBRGreen PCR Kit說明書所述，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版在LC 480熒光定量PCR儀上進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：模板cDNA 1μl，2＊QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix 10μl，miR-20b上游引物1μl，10＊miScript通用引物2μl，加無酶水至總反應(yīng)體積20μl。miR-20b上游引物為5′-AAGTGCTCATAGTGCAG-3′，下游引物使用Qiagen公司提供的通用引物。內(nèi)參基 因 采 用 U6snRNA，其 上 游 引 物 是：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃15min，94℃15s，之后55℃30s，70℃30s，共計40個循環(huán)。

七、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

以U6為內(nèi)參進行標準化處理，RT-qPCR所得數(shù)據(jù)使用ΔΔCT法分析：ΔCT＝ CTmiR-20b-CTU6，ΔΔCT＝ΔCTRCC-ΔCTNormal。通過計算2-△CT將得到的ΔCT值還原為miR-20b的相對表達量，經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換，符合正態(tài)分布。通過計算2-△△CT得到癌組織中miR-20b表達量相對于配對癌旁組織表達量的倍數(shù)，采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。采用配對t檢驗比較腎癌和癌旁正常組織中miR-20b表達水平，采用四格表χ2檢驗或Fisher確切概率分析miR-20b表達水平與患者的臨床病理特征的聯(lián)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-20b在腎癌及配對癌旁組織中的表達量

miR-20b在腎癌組織中的表達水平明顯低于配對癌旁組織。通過2-△CT計算miR-20b在腎癌組織和配對組織中的相對表達量并作圖，結(jié)果如圖1所示，配對t檢驗分析P＜0.05。通過2-△△CT計算miR-20b在腎癌組織中表達量相對配對癌旁組織表達量倍數(shù)的平均值±標準誤，為1.020±0.210，最小值為0.051，最大值為7.013；其中，表達量倍數(shù)高于1.020＋0.210的視為表達上調(diào)，低于1.020-0.210的視為表達下調(diào)，其余則為表達無明顯差異。腎癌組織miR-20b表達量與配對癌旁組織表達量比值進行l(wèi)og2（T／N）轉(zhuǎn)換，結(jié)果如圖2所示，表達下調(diào)的為29例（69.048%），表達上調(diào)的為11例（26.190%），表達無明顯差異的為2例（4.762%）。

二、miR-20b表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性

以腎癌組織miR-20b相對表達量平均值1.104為界，將研究病例分為高表達組、低表達組，其中低表達29例，高表達13例。按性別分為男性組及女性組，以患者年齡中位數(shù)51歲為界將患者分為＜51歲組和≥51歲組。進行四格表χ2檢驗分析，結(jié)果顯示腎癌中miR-20b表達水平與患者年齡、腎癌組織類型、性別、AJCC臨床分期、TNM分期無明顯相關(guān)性（P＞0.05），結(jié)果見表1。但該研究結(jié)果不能排除病例數(shù)較少所致偏倚，需要擴大樣本量進一步驗證。

圖1 miR-20b在腎癌組織和癌旁組織中的ΔCT比較（ΔCT＝CTmiR-20b-CTU6）

圖2 miR-20b在42例配對的腎癌和癌旁組織中的相對表達量比值（橫坐標為標本序號，縱坐標為miR-20b在腎癌與正常組織中表達量比值的對數(shù)值；條帶：灰色為表達下調(diào)，黑色為表達上調(diào)，白色為表達無明顯差異）

表1 miR-20b表達量與臨床病理特征之間的關(guān)系

討 論

和大多數(shù)腫瘤一樣，腎癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚不清楚。三分之一的腎癌患者在初次診斷時已經(jīng)存在遠處轉(zhuǎn)移，其中近30%的病例手術(shù)后會有復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移［2］。因此尋找可用于腎癌早期診斷的生物標志物顯得尤為重要。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些和腎癌診斷及惡性程度相關(guān)的生物標志物，但在臨床上并無相關(guān)標志物的應(yīng)用，關(guān)于這些標志物的作用機制仍需要進一步的研究?，F(xiàn)階段常規(guī)的臨床分期和病理分期在腎癌預(yù)后的判斷中仍起主要作

用［12］。

從miRNA被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，人們對miRNA的研究在逐漸深入。多項研究表明，miRNAs在多種腫瘤細胞中存在異常表達，比如在黑色素瘤中低表達的 miR-205、miR-211［13］，在結(jié)腸癌中高表達的miR-31［14］，因此根據(jù)miRNA的表達水平不同可以把miRNA分為促癌miRNA和抑癌miRNA，即腫瘤組織中高表達的miRNA可能起到類似于促癌基因的作用，而低表達的miRNA可能具有抑癌基因的作用。在一定的條件下，miRNA通過非特異性結(jié)合靶基因mRNA3′端非編碼區(qū)來抑制其轉(zhuǎn)錄或使其降解來調(diào)控靶基因表達，從而發(fā)揮著基因調(diào)控作用［15-16］。由于 miRNA結(jié)合的不完全性，一個miRNA可以和多個基因結(jié)合，而多個miRNA也可以和同一個基因結(jié)合，從而構(gòu)成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前在腫瘤的靶向治療方面，靶點的選擇只是局限于單個異?；颍玬iRNA可以和多個基因位點結(jié)合，通過調(diào)節(jié)組織中miRNA的水平即可達到同時調(diào)控多個基因的目的。因此，在腫瘤的分子靶向治療方面miRNA有著獨特的優(yōu)勢，所以有必要深入研究miRNA對靶基因的調(diào)控機制，以期在腫瘤分子靶向治療方面取得新的突破。

在先前測序及篩選的基礎(chǔ)上，本研究通過逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測標本中miR-20b的表達水平，并分析其與病例臨床特征的相關(guān)性。經(jīng)統(tǒng)計分析，miR-20b表達水平與患者臨床特征無明顯相關(guān)性?，F(xiàn)階段的研究表明，miR-20b在其他病變組織中也存在著異常表達。目前已有報道證實在乳腺癌中miR-20b表達水平升高，且可通過作用于人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因來促進細胞增殖［17］。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-20b可以通過和RORγt、STAT3結(jié)合來抑制Th17細胞的分化以及腦脊髓炎的發(fā)生［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在腎癌細胞中表達下降，表明其在腎癌中的作用機制與在乳腺癌中有所不同。miR-20b在腎癌組織中明顯的低表達，其表達水平是癌旁組織的1.020±0.210倍，提示其可能在基因調(diào)控方面發(fā)揮著抑癌基因的作用，這可能在腎癌的早期診斷及預(yù)后判斷方面有一定的臨床意義。確定miR-20b表達存在差異后，下一步將是收集更多腎癌標本檢測miR-20b的表達，進一步驗證miR-20b與腎癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系并通過體外轉(zhuǎn)染的方法對miR-20b進行功能研究，主要包括研究轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞的增殖能力、侵襲能力、凋亡水平等方面的變化。目前普遍認為，miRNA通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)行為，因此我們下一步的研究將是如何有效地將特異性較高的miR-20b和其抑制物導(dǎo)入到腎癌細胞中，通過對轉(zhuǎn)染后細胞的功能研究，進一步明確miR-20b在腎癌的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在腎癌組織中表達下調(diào)，且其表達水平與患者臨床病理特征無明顯相關(guān)性。目前關(guān)于miR-20b的功能研究尚處于探索階段，但根據(jù)目前研究狀況，探究其對癌細胞功能的影響，尋找其靶基因及作用通路已成為明確目標。本研究為miR-20b在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制以及其在腎癌中的診斷價值等后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Alt AL，Boorjian SA，Lohse CM，et al.Survival after complete surgical resection of multiple metastases from renal cell carcinoma［J］.Cancer，2011，117（13）：2873-2882.

［2］ Tostain J，Li G，Gentil-Perret A，et al.Carbonic anhydrase 9in clear cell renal cell carcinoma：A marker for diagnosis，prognosis and treatment［J］.Eur J Cancer，2010，46（18）：3141-3148.

［3］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［4］ Li M，Zhang G，Zhang X，et al.Overexpression of B7-H3in CD14（＋）monocytes is associated with renal cell carcinoma progression［J］.Med Oncol，2014，31（12）：349.

［5］ Rasmussen F.Metastatic renal cell cancer［J］.Cancer Imaging，2013，13（3）：374-380.

［6］ Coskun M，Bjerrum JT，Seidelin JB，et al.miR-20b，miR-98，miR-125b-1＊，and let-7e＊as new potential diagnostic biomarkers in ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol，2013，19（27）：4289-4299.

［7］ Hoheisel JD，Wang X，Sundquist J，et al.Determination of 14Circulating microRNAs in Swedes and Iraqis with and without Diabetes Mellitus Type 2［J］.PloS one，2014，9（1）：e86792.

［8］ Juan D，Alexe G，Antes T，et al.Identification of a MicroR-NA Panel for Clear-cell Kidney Cancer［J］.Urology，2010，75（4）：835-841.

［9］ Friedman RC，F(xiàn)arh KK，Burge CB，et al.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs［J］.Genome Res，2009，19（1）：92-105.

［10］ Grange C，Collino F，Tapparo M，et al.Oncogenic micro-RNAs and renal cell carcinoma［J］.Front Oncol，2014，4：49.

［11］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31（6）：659-666.

［12］ Wood CG.Molecular markers of prognosis in renal cell carcinoma：Insight into tumor biology helps define risk and provides targets for therapy［J］.J Surg Oncol，2006，94（4）：264-265.

［13］ Xu Y，Brenn T，Brown ER，et al.Differential expression of microRNAs during melanoma progression：miR-200c，miR-205and miR-211are downregulated in melanoma and act as tumour suppressors［J］.Br J Cancer，2012，106（3）：553-561.

［14］ Wang S，Hu J，Zhang D，et al.Prognostic role of microRNA-31in various cancers：a meta-analysis［J］.Tumour Biol，2014，35（11）：11639-11645.

［15］ Xu L.miR-203regulates the proliferation，apoptosis and cell cycle progression of pancreatic cancer cells by targeting Survivin［J］.Mol Med Rep，2013，8（2）：379-384.

［16］ Zhai Q，Zhou L，Zhao C，et al.Identification of miR-508-3p and miR-509-3p that are associated with cell invasion and migration and involved in the apoptosis of renal cell carcinoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，419（4）：621-626.

［17］ Zhou W，Shi G，Zhang Q，et al.MicroRNA-20bpromotes cell growth of breast cancer cells partly via targeting phosphatase and tensin homologue（PTEN）［J］.Cell Biosci，2014，4（1）：62.

［18］ Zhu E，Wang X，Zheng B，et al.miR-20bsuppresses Th17 differentiation and the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis by targeting RORgammat and STAT3［J］.J Immunol，2014，192（12）：5599-5609.