64組家庭人畜共患皮膚癬菌病分析

夏修蛟 劉澤虎 沈宏 許愛娥

·論著·

64組家庭人畜共患皮膚癬菌病分析

夏修蛟 劉澤虎 沈宏 許愛娥

目的 了解人畜共患皮膚癬菌病病原菌分布及流行病學(xué)情況。方法 收集患者和所養(yǎng)寵物均培養(yǎng)出皮膚癬菌的64組病例，按家庭分組進(jìn)行調(diào)查分析，同時(shí)運(yùn)用ITS序列測定和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）進(jìn)行分子鑒定，分析兩者的同源性。結(jié)果 64組組內(nèi)均培養(yǎng)出同一菌種，共分離出146株菌，菌種為犬小孢子菌（93株）或指（趾）間毛癬菌（53株），其中42組分離出犬小孢子菌（65.7%），22組分離出指（趾）間毛癬菌（34.3%）。14個(gè)養(yǎng)兔組、6個(gè)養(yǎng)貓組、2個(gè)養(yǎng)狗組均培養(yǎng)出指（趾）間毛癬菌，34個(gè)養(yǎng)貓組、8個(gè)養(yǎng)狗組培養(yǎng)出犬小孢子菌。有明顯臨床癥狀（紅斑脫屑、脫毛等）的寵物54只（75.0%），無明顯癥狀的18只（25.0%，全部是貓）。18只無癥狀貓中，14只培養(yǎng)出犬小孢子菌，4只培養(yǎng)出指（趾）間毛癬菌。ITS序列測定和RAPD顯示組內(nèi)病原菌間具有高度同源性。結(jié)論 犬小孢子菌和指（趾）間毛癬菌是人畜共患皮膚癬菌病的主要病原菌，兩者具有宿主特異性，人畜傳播是人畜共患皮膚癬菌病的傳播途徑，應(yīng)重視無臨床癥狀動(dòng)物（攜帶者）。

癬；小孢子菌屬；發(fā)癬菌屬；寵物；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)；動(dòng)物傳染病

隨著城市寵物熱的興起，人畜共患皮膚癬菌病已成為不可忽視的公共健康問題。皮膚癬菌的人和動(dòng)物傳播鏈的證實(shí)均是基于真菌培養(yǎng)的結(jié)果，極少對這些病原菌進(jìn)行分子鑒定［1］。我們于2012年11月至2014年2月，在對明確豢養(yǎng)寵物的體癬患者進(jìn)行問卷調(diào)查和真菌學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，篩選出64組患者和寵物均培養(yǎng)出皮膚癬菌的病例進(jìn)行分析，并對所分離菌株進(jìn)行ITS序列測定和隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）分析，以期了解人畜共患皮膚癬菌病的菌種分布情況和同源性。

資料和方法

一、資料

1.臨床資料：74例患者中女58例，男16例，年齡5～62歲，平均22.1歲。病程2 d至1.5個(gè)月，平均病程15.8 d。皮損分布：單處皮損25例，占33.8%；皮損 ≥ 2處 49例，占 66.2%；共 210處皮損，其中位于上肢52處，占24.8%；頭面部50處，占23.8%；前胸27處，占12.9%；肩背部25處，占11.9%；頸部25處，占11.9%；腹部17處，占8.1%；下肢10處，占4.8%；股部2處，占0.9%；手背2處，占0.9%。伴明顯水皰或膿皰的38例，占51.4%；水皰或膿皰不明顯36例，占48.6%。

2.寵物情況：送檢的寵物72只，其中貓44只（61.1%），兔16只（22.2%），狗12只（16.7%）?；筐B(yǎng)時(shí)間2周至3年不等，平均豢養(yǎng)115 d。有明顯臨床體征（紅斑脫屑、脫毛等）54只（75.0%），無明顯臨床體征18只（25.0%，全部是貓）。54只有癥狀寵物中，皮損處≥2處41只（75.9%），皮損主要分布于面部、耳朵、四肢、背部、尾巴等。見圖1～3。

3.分組：按家庭分組，共分為64組，其中10個(gè)組有2例患者（屬父母子女關(guān)系6組，兄弟姐妹關(guān)系3組，1組為大學(xué)室友關(guān)系），54組只有1例患者。組內(nèi)寵物情況：56組只有1只寵物，8組有2只寵物，其中送檢2只貓的4個(gè)組，送檢2只狗和送檢2只兔分別為2個(gè)組。按寵物種類分組，則有養(yǎng)貓組40個(gè)，養(yǎng)兔組14個(gè)，養(yǎng)狗組10個(gè)。

圖1 按家庭分組的患者與寵物臨床表現(xiàn) 1A：患者女，39歲，前臂見皮損炎癥反應(yīng)明顯；1B：患者母親（62歲）腹部環(huán)形紅斑；1C：寵物加菲貓無臨床癥狀

圖2 按家庭分組的患者與寵物臨床表現(xiàn) 2A：患者女，12歲，下頜部皮損；2B：豢養(yǎng)的兔頭面部、四肢大片紅斑脫屑脫毛；2C：兔眼周見紅斑脫屑

圖3 按家庭分組的患者與寵物臨床表現(xiàn) 3A：患者女，20歲，肩背部皮損；3B：豢養(yǎng)的寵物貓（英國短毛）無臨床癥狀；3C：患者發(fā)病前1個(gè)月收養(yǎng)的流浪貓，頭頸部見一環(huán)形紅斑脫屑區(qū)

二、方法

1.真菌學(xué)檢查：對患者和所養(yǎng)寵物行真菌學(xué)檢查，對于有癥狀寵物，用柳葉刀或拔毛鑷采集皮損處皮屑或毛發(fā)，對于無癥狀寵物，則利用上述工具進(jìn)行多點(diǎn)采集，這些部位主要包括：頭面部、背部、四肢等。采集后一部分標(biāo)本置載玻片，滴加10%KOH后直接鏡檢，另一部分標(biāo)本則多點(diǎn)接種于3個(gè)以上含放線菌酮的9 cm SDA平皿上，放入25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，根據(jù)菌落形態(tài)和鏡下特征鑒定菌種。

2.分子生物學(xué)程序：所有菌株經(jīng)多次純化接種后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因分析。DNA提取采用SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒，按說明書提取。采用通用引物：ITS1：5′-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3′（20 bp），ITS4：5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′（19 bp）。PCR擴(kuò)增按常規(guī)程序操作［2］，產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖切膠純化后，PCR純化產(chǎn)物27f和1492r進(jìn)行測序（美國ABI公司3730序列分析儀），測序結(jié)果在基因庫上進(jìn)行比對。RAPD 分析：選用 6 條引物：ATGS：5′-ATGGATCSS C-3′；OPAO-15：5′-GAAGGCTCCC-3′；P1：5′-ATA ACGGGCCTGTCGCCAG-3′；P2：5′-CCCAGCTGTG-3′；P3：5′-AGCACCCGGTACA-3′；P4：5′-GGTTGGGTG AGAATTGCACG-3′。PCR 擴(kuò)增按常規(guī)程序操作［2］，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠（含0．5 g/L溴化乙錠）100 V、90min電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

結(jié) 果

一、真菌學(xué)檢查

直接鏡檢：74例患者全部陽性，54只有明顯皮損的寵物全部陽性，18只無皮損寵物貓中，4只陽性，14只陰性。培養(yǎng)結(jié)果：共分離出146株菌，其中犬小孢子菌93株，須癬毛癬菌（復(fù)合體）53株。18只無癥狀寵物貓中14只培養(yǎng)出犬小孢子菌，4只培養(yǎng)出須癬毛癬菌（復(fù)合體）。同一組中患者和寵物均培養(yǎng)出同一菌種。64組中，42組分離出犬小孢子菌（65.7%），22組分離出須癬毛癬菌（復(fù)合體）（34.3%）。14個(gè)養(yǎng)兔組均培養(yǎng)出須癬毛癬菌（復(fù)合體），34個(gè)養(yǎng)貓組培養(yǎng)出犬小孢子菌，6個(gè)養(yǎng)貓組培養(yǎng)出須癬毛癬菌（復(fù)合體），8個(gè)養(yǎng)狗組培養(yǎng)出犬小孢子菌，2個(gè)養(yǎng)狗組培養(yǎng)出須癬毛癬菌（復(fù)合體）。寵物真菌學(xué)檢查見表1。

表1 72只寵物真菌學(xué)檢查結(jié)果

二、分子鑒定

93株犬小孢子菌的序列數(shù)據(jù)經(jīng)基因庫比對，與Arthroderma otae isolate 100（登錄號 JN134109.1）、Arthroderma otae isolate IFM 46803（登錄號AB193649.1）等標(biāo)準(zhǔn)株符合率達(dá)100%或99%。53株須癬毛癬菌（復(fù)合體）則與Arthroderma vanbreuseghemii strain WCH-AV004（登錄號 GQ140347.1）、Arthroderma vanbreuseghemii strain IFM 56843（登錄號 AB456737.1）、Trichophyton interdigitaleisolate 558（登錄號JN134005.1）等標(biāo)準(zhǔn)株符合率達(dá)100%或99%。53株菌均鑒定為須癬毛癬菌復(fù)合體中的指（趾）間毛癬菌。同一家庭組內(nèi)成員分離株之間進(jìn)行比對，符合率也達(dá)100%或99%。

RAPD分型：93株犬小孢子菌由6條引物分別擴(kuò)增后，引物P2產(chǎn)生的條帶缺失較多，譜型不清；其他5條引物中，引物ATGS和P3產(chǎn)生的條帶譜型清晰，無一缺失，其余3條引物均有2～4個(gè)菌株條帶缺失。93株犬小孢子菌由引物ATGS、OPAO、P1、P4擴(kuò)增的帶型，分為2個(gè)帶型，由引物P3擴(kuò)增的帶型，分為4個(gè)帶型。53株指（趾）間毛癬菌由6條引物分別擴(kuò)增后，引物P1產(chǎn)生的條帶缺失嚴(yán)重，由引物ATGS擴(kuò)增的帶型，分為2個(gè)帶型，其他引物擴(kuò)增的條帶只有1種帶型。分離出犬小孢子菌的42組中，同一組內(nèi)帶型完全相同28組（66.7%），不一致14組（33.3%），見圖4。分離出指（趾）間毛癬菌的22組中，15組帶型完全相同（68.2%），不一致7組（31.8%），見圖5。

圖4 部分犬小孢子菌DNA用引物ATGS擴(kuò)增后的RAPD帶型圖 第1組：B與C帶型一致，A不同，A為患者，B為患者母親，C為貓，貓無臨床癥狀；第2組：帶型稍有差異，A為患者，B為貓；第3組：帶型基本一致，A為患者，B為貓；第4組：帶型完全一致，A、B為姐弟倆，C為貓；第5組：帶型有顯著差異，A為患者，B為狗；第6組：帶型完全一致，A為患者，B為狗；第7組：帶型完全一致，A為患者，B為貓；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖5 部分趾間型毛癬菌DNA用引物ATGS擴(kuò)增后的RAPD帶型圖 第1、3、4、6、7組：帶型完全一致，第1組A為患者，B為狗，其余各組A為患者，B為兔子；第2組帶型基本一致，A為患者，B、C分別為兩只兔

討 論

親動(dòng)物性皮膚癬菌中的一些種屬往往有特定的宿主［3］。犬小孢子菌是貓和狗的優(yōu)勢病原菌，在歐洲，貓的皮膚癬菌病50%～90%由犬小孢子菌引起［4］。巴西的一項(xiàng)調(diào)查顯示，92.6%的狗和100%的貓的皮膚癬菌病病原菌是犬小孢子菌［5］。指（趾）間毛癬菌常見于豚鼠和兔，Kraemer等［6］分析了 1 132份從豚鼠和1 021份從兔體表采集的標(biāo)本，分離出的皮膚癬菌中，指（趾）間毛癬菌分別占91.6%和72.3%。如表1所示，大部分貓和狗分離菌是犬小孢子菌，指（趾）間毛癬菌是兔的唯一病原菌，未見石膏樣小孢子菌，與上述調(diào)查基本一致。胡素泉等［7］調(diào)查了15例人畜共患體癬，8例為石膏樣小孢子菌，4例為指（趾）間毛癬菌，3例為犬小孢子菌，與本項(xiàng)目分離結(jié)果差距較大，但是有一共同點(diǎn)，指（趾）間毛癬菌是兔的主要病原菌，可能因?yàn)檫@種菌更適應(yīng)于在這個(gè)動(dòng)物生長［8］。病原譜的不同可能與地域有關(guān)，該作者認(rèn)為江蘇以沙土為主，導(dǎo)致病原菌以親土性的石膏樣小孢子菌為主。這些不同種屬的病原菌有著不同的特定宿主，其中的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)也為我們今后采取干預(yù)和預(yù)防措施提供了很好的思路。在1960年代，人們便制備出了疣狀毛癬菌疫苗，經(jīng)過不斷完善，該疫苗的使用減少了挪威等歐洲國家牛的皮膚癬菌病發(fā)病率［9］。

皮膚癬菌特別是犬小孢子菌，可以分離自無臨床癥狀動(dòng)物（攜帶者），貓是其中的主要攜帶者，?？蓮恼５呢埳戏蛛x出犬小孢子菌［10］。意大利的一項(xiàng)研究顯示，173只正常流浪貓中有82只（47.4%）分離出犬小孢子菌，3只分離出指（趾）間毛癬菌［11］。我們的數(shù)據(jù)顯示，72只寵物中有18只（25.0%）貓無臨床癥狀，其中14只分離出犬小孢子菌，只有4只分離出指（趾）間毛癬菌。從以上數(shù)據(jù)可以看出，無論貓或狗、無論有無皮損，犬小孢子菌都是優(yōu)勢菌［12］。因此，這些無癥狀的攜帶者，特別是貓，常起到犬小孢子菌的“蓄水池”作用。犬小孢子菌和指（趾）間毛癬菌感染的臨床表現(xiàn)取決于宿主、真菌種類和酶產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)顯示，指（趾）間毛癬菌感染后的兔是否出現(xiàn)皮損與彈性蛋白酶和明膠酶活力有關(guān)，而犬小孢子菌感染則與脂肪酶活力有關(guān)［8］。Galuppi等［10］提出，當(dāng)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)≥10 cfu時(shí)，應(yīng)視無皮損的貓為感染狀態(tài)且需要治療，而不能僅視作攜帶者，只有菌落數(shù)≤9 cfu時(shí)，才可視為攜帶者。實(shí)驗(yàn)顯示，有皮損或菌落數(shù)≥10 cfu的無皮損貓，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平顯著高于低培養(yǎng)菌落數(shù)的無皮損貓［10］。高濃度的糖皮質(zhì)激素會打破Th1和Th2的平衡，抑制細(xì)胞免疫［13］。值得指出的是，動(dòng)物身上的皮損常散發(fā)，容易被常規(guī)檢查忽視，因此真菌學(xué)檢查非常重要。對于這些動(dòng)物而言，提高真菌學(xué)檢查陽性率的關(guān)鍵是多點(diǎn)取材，多點(diǎn)接種。

親動(dòng)物性皮膚癬菌常通過直接接觸感染動(dòng)物或間接接觸感染動(dòng)物污染物而傳播。我們調(diào)查的64組病例，都豢養(yǎng)寵物，患者主要是女性，符合女性更喜歡寵物的特點(diǎn)，從患者皮損的分布來看，依次是上肢（24.8%）、頭面部（23.8%）、前胸（12.9%）、肩背部（11.9%）、頸部（11.9%）等，明顯符合抱寵物時(shí)的姿勢，間接證明這些患者大部分是由于直接接觸寵物而感染。我們的結(jié)果顯示，不同于親人性皮膚癬菌病，超過一半的患者炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈且泛發(fā)，提示我們這些親動(dòng)物性皮膚癬菌病危害更大。有意義的一點(diǎn)是，我們的項(xiàng)目中有18組由3例成員構(gòu)成，其中9組患者系家庭成員關(guān)系，另外8組由1例患者和2只寵物構(gòu)成，提示這些成員之間長期密切接觸，導(dǎo)致傳播鏈形成。如圖1所示的加菲貓無癥狀，培養(yǎng)結(jié)果顯示它是犬小孢子菌的攜帶者，導(dǎo)致母女二人患病，與之對應(yīng)的圖4中第1組條帶顯示，母親分離菌的帶型與加菲貓分離菌的帶型一致，而女兒分離菌的帶型與二者有一定差異，提示可能由加菲貓先行傳播給母親，而后傳播給女兒。圖3所示是一個(gè)很有趣的病例組，涵蓋了患者、攜帶者和發(fā)病貓，推測可能的傳播路徑是：由于流浪貓的傳播，導(dǎo)致寵物貓成了攜帶者，進(jìn)而引起患者發(fā)病。

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2014-06-27）

（本文編輯：吳曉初）

Analysis of zoonotic dermatophytoses in 64 family-based groups

Xia Xiujiao,Liu Zehu,Shen Hong,Xu Ai′e.Department of Dermatology,Third People′s Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310009,China

Xia Xiujiao,Email:804534095@qq.com

ObjectiveTo investigate the distribution and epidemiology of fungal pathogens in zoonotic dermatophytoses.MethodsSeventy-four patients with dermatophytoses and 72 pets from 64 families,who were all culture positive for dermatophytes,were included in this study and classified into 64 family-based groups.Fungal culture and direct microscopic examination were carried out for species identification of fungal isolates,internal transcribed spacer（ITS）sequence analysis and random amplified polymorphic DNA（RAPD）analysis were performed for molecular identification and homology analysis.ResultsDermatophyte species were consistent among the patients and pets from the same families for all the 64 family-based groups.A total of 146 fungal strains were isolated,including 93Microsporum canis（M.canis）strains and 53Trichophyton interdigitale（T.interdigitale）strains.M.caniswas isolated from 42（65.7%）family-based groups including 34 groups keeping cats and 8 groups keeping dogs,whileT.interdigitalefrom 22（34.3%）groups,including 14 groups keeping rabbits,6 groups keeping cats and 2 groups keeping dogs.There were 54（75.0%）pets with obvious clinical symptoms（erythema,desquamation,depilation,etc）,and 18（25.0%）asymptomatic pets which were all cats.Among the 18 asymptomatic cats,14 carriedM.canis,and 4T.interdigitale.ITS sequencing and RAPD analysis revealed a high homology between the fungal pathogens in the same family-based groups.ConclusionsM.canisandT.interdigitaleare common species of dermatophytes in zoonotic dermatophytoses,and both of them have host specificity.Zoonotic dermatophytes can be transmitted between human and domestic animals,and attention should be paid to asymptomatic animals（carriers）.

Tinea;Microsporum;Trichophyton;Pets;Random amplified polymorphic DNA technique;Zoonoses

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.003

杭州市科技局醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)?？茖２】蒲泄リP(guān)專項(xiàng)（20120533Q08）

310009杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

夏修蛟，Email：804534095@qq.com