牦牛腸黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的比較觀察

楊學軍方梅左愈臻李棟趙興緒賈寧*

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 730070；2，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 730046）

牦牛腸黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的比較觀察

楊學軍1,2方梅1左愈臻1李棟1趙興緒1賈寧1*

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 730070；2，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 730046）

為了揭示牦牛腸道黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的分布特點與規(guī)律，本研究采用組織學及透射電鏡等技術，對牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的分布進行了比較研究。結果顯示，牦牛腸黏膜有多量漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞分布，且分布不均勻。漿細胞在整個腸道以盲腸黏膜最豐富；肥大細胞在十二指腸黏膜分布最多；杯狀細胞在直腸黏膜分布最多。超微結構顯示，漿細胞呈圓形或橢圓形，染色質沿核膜排列，胞漿中有豐富的內質網(wǎng)；杯狀細胞呈高腳杯狀，細胞頂端含有大量的分泌顆粒而膨大；肥大細胞呈橢圓形，胞質內充滿高電子密度的大小不等的膜包顆粒。研究證明，牦牛腸道各段有規(guī)律的分布了豐富的漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞，顯示牦牛腸道黏膜具有很強的黏膜免疫屏障功能。

牦牛；腸道黏膜；上皮內淋巴細胞；電鏡；分布特點；比較研究

牦牛（yak）是青藏高原特有的珍稀畜種，其對高寒、缺氧、低壓、強紫外線照射等多種環(huán)境刺激具有極強的適應性[1]。因此，牦牛消化道黏膜免疫特性應具有獨特的適應基礎。家畜腸道不僅具有對營養(yǎng)物質消化和吸收的功能，同時也具有免疫屏障功能[2]。已有學者對相關動物腸道黏膜上皮內淋巴細胞的分布和數(shù)量進行了研究[3，4]。到目前為止，有關牦牛腸道黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的分布特點和比較變化規(guī)律，尚未見系統(tǒng)報道。本研究對牦牛腸道黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的分布進行了比較觀察，探討牦牛腸道黏膜的屏障特性。

1 材料與方法

1.1 動物及樣品處理

16例牦牛（10♂6♀）均來自青海某屠宰場。經(jīng)頸動脈放血處死后，迅速切取十二指腸、空腸、回腸、結腸、盲腸和直腸數(shù)段。每例牦牛十二指腸、空腸、回腸、盲腸與直腸每隔10cm取一塊（約5cm），分別取4塊。牦牛結腸較長，每例結腸每隔80cm取一塊（約5cm），共取8塊。樣品置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定。同時，在牦牛放血處死后30min內切取腸道各段黏膜（1mm3）數(shù)塊電鏡樣品，于2%多聚甲醛–2.5%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱保存。

1.2 石蠟切片與染色

固定后的樣品，常規(guī)石蠟包埋，制備連續(xù)切片。HE染色、Masson三色染色、PAS（高碘酸–Schiff氏）染色、MGP（甲基綠派洛寧，Methyl green-Pyronin）染色及MTB（甲苯胺藍）染色，光鏡觀察。

1.3 透射電鏡觀察

對所取電鏡材料采用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液預固定后，再經(jīng)1%鋨酸PBS溶液后固定，丙酮乙醇梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾與硝酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.4 測量與數(shù)據(jù)處理

采用光鏡對牦牛腸道各段連續(xù)切片進行觀察、拍照，以及測量、統(tǒng)計（采用Image-Pro Plus軟件）。每段腸道做連續(xù)切片，每隔十張取一張，共取5張。選取腸道各段黏膜上皮細胞排列整齊連續(xù)的切片，統(tǒng)計每150個上皮細胞間的淋巴細胞數(shù)量。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和比較（采用SPSS 17.0軟件）。

2 結果

研究結果表明，牦牛腸道漿細胞主要分布于腸黏膜固有層的腸腺之間，胞核位于細胞中央或一端。在整個腸道中漿細胞數(shù)量在盲腸分布最豐富（圖1）。小腸從十二指腸、空腸到回腸漿細胞逐漸增多且差異顯著（P＜0.05），盲腸達到最多，從盲腸、結腸至直腸依次減?。ū?）。杯狀細胞散在于腸黏膜上皮細胞和腸腺柱狀細胞之間，細胞頂部因含有糖原顆粒而膨大，底部纖細，呈典型的高腳杯狀（圖1）。杯狀細胞在直腸數(shù)量最多（表1）（圖2），在盲腸最少，兩者差異顯著（P＜0.05），結腸與直腸之間差異不顯著，結腸與盲腸之間差異顯著（P＜0.05）（表1）。直腸因杯狀細胞分泌大量黏液，使黏膜表面覆有厚層黏性薄膜。在小腸杯狀細胞由十二指腸到回腸也是逐漸減少且差異顯著（P＜0.05）（表1）。肥大細胞大多分布于腸黏膜固有層腸腺及小血管和小淋巴管周圍，黏膜下層、肌層和漿膜有少量分布。肥大細胞數(shù)量在十二指腸黏膜分布最多（圖3），由十二指腸到回腸逐漸減少且差異顯著（P＜0.05）（表1）。大腸肥大細胞與小腸比較相對較少，且結腸和盲腸差異不顯著，直腸分布最少（表1）。

圖1 牦牛盲腸黏膜豐富的漿細胞，HE染色×400

圖2 牦牛直腸黏膜豐富的杯狀細胞，PAS染色×400

圖3 牦牛十二指腸黏膜豐富的肥大細胞，甲苯胺藍染色×400

表1 牦牛腸道黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞分布變化（n=150）

電鏡下，漿細胞呈橢圓形，核膜清晰，胞質中除少量線粒體外，幾乎充滿粗糙型內質網(wǎng)（圖4）。杯狀細胞頂端呈不規(guī)則游離面，散在于柱狀細胞之間，細胞間界限輪廓清晰，頂部側面與相鄰細胞以中間連接和橋粒相連，胞質中充滿著黏液顆粒，有些顆粒相互融合，成為較大的分泌泡。肥大細胞呈橢圓形，細胞核較大，核膜清晰可見，胞質內有高電子密度的大小不等的圓形顆粒聚集（圖5）。

圖4 牦牛腸道黏膜漿細胞，×12000

圖5 牦牛腸道黏膜肥大細胞，×12000

3 討論

腸道不僅是消化、吸收營養(yǎng)物質的場所，而且具有重要的免疫屏障功能[5]。黏膜的防御功能與黏膜的各種免疫相關細胞的數(shù)量和分布密切相關。漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞在腸黏膜免疫屏障中扮演著重要的角色。腸黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞作為腸道相關淋巴組織中的一個特殊組分，是機體免疫系統(tǒng)中與外來抗原以及微生物發(fā)生接觸的重要免疫細胞，同時也是產(chǎn)生免疫應答反應的重要細胞[6，7]，可誘導產(chǎn)生一系列黏膜免疫應答。因此，腸道黏膜漿細胞、肥大細胞與杯狀細胞的數(shù)量可以反映腸道局部黏膜免疫屏障的完整及免疫防御功能的完善程度。本研究表明，牦牛腸道漿細胞主要分布于腸黏膜固有層的腸腺之間，胞核位于細胞中央或一端。在整個腸道中漿細胞數(shù)量在盲腸分布最豐富。而漿細胞是B淋巴細胞發(fā)育的最終階段，主要參與體液免疫[8，9]。大量IgA可通過分泌片段的介導進入腸黏膜表面，中和抗原物質（如細菌、毒素等），起到清除外來抗原和保護機體的作用[10]。

本研究也表明，牦牛腸道杯狀細胞散在于腸黏膜上皮細胞和腸腺柱狀細胞之間，細胞頂部因含有糖原顆粒而膨大，底部纖細，呈典型的高腳杯狀。杯狀細胞在直腸數(shù)量最多。直腸因杯狀細胞分泌大量黏液，使黏膜表面覆有厚層黏性薄膜。而分泌黏蛋白是杯狀細胞的主要功能之一。黏蛋白可對機體腸黏膜起到機械性保護作用，是腸道機械屏障的組成之一[9-11]。

牦牛腸道肥大細胞大多分布于腸黏膜固有層腸腺及小血管和小淋巴管周圍，黏膜下層、肌層和漿膜有少量分布。肥大細胞數(shù)量在十二指腸黏膜分布最多。而肥大細胞源于骨髓造血干細胞，其增殖分化成熟中隨血流遷移至結締組織。一方面，在動物機體天然免疫中肥大細胞發(fā)揮著重要的作用；另一方面，肥大細胞還能產(chǎn)生多種生物活性物質，通過這些生物活性物質參與機體獲得性免疫[11，12]。

總之，牦牛腸道黏膜具有豐富的漿細胞、肥大細胞和杯狀細胞，其分布并不均勻，它們在牦牛對環(huán)境適應及黏膜免疫屏障保護中具有十分重要的作用。

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[2]Gaskins H R.The intestinal immune system:gut reaction and growth of the pig[J].A nim Sci,1996,74(Suppl1):169.

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[5]魯延剛,高世杰,方梅,等.牦牛皺胃組織結構及黏膜免疫相關細胞研究.畜牧獸醫(yī)學報,2012,43(3):469-475.

[6]宋恩亮,陳耀星,王子旭,等.利雜犢牛小腸各段長度與黏膜結構的發(fā)育學變化[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(5):66-70.

[7]宋恩亮,陳耀星,王子旭,等.肉犢牛小腸黏膜免疫相關細胞的數(shù)量變化研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2007,38(10):1109-1114.

[8]Bauer E,Williams B A,Smidt H.Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals.Curr Issues Intest Microbiol,2006,7(2):35-51.

[9]Bauer E,Williams B A,Smidt H.Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals.Curr Issues Intest Microbiol,2006,7(2):35-51.

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[11]Metz M,Siebenhaar F,Maurer M.Mast cell functions in the innate skin immune system[J].Immunobiology,2008,213(3):251-260.

[12]姜楠,胡易,陳耀星,等.肥大細胞在動物腸道黏膜免疫屏障中的作用[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(4):167-170.

甘肅省自然科學基金項目，編號：1308RJZA220。

楊學軍（1968-），男，碩士，副研究員，主要從事預防獸醫(yī)學研究。

?通訊作者：賈寧，教授，主要從事基礎獸醫(yī)學研究。