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    疊層自組裝技術(shù)在根面構(gòu)建緩釋系統(tǒng)的研究

    2015-11-28 07:15:47張弘岑蓮?fù)艨?/span>
    組織工程與重建外科雜志 2015年3期
    關(guān)鍵詞:根面疊層外源性

    張弘岑 蓮?fù)艨?/p>

    ·論著·

    疊層自組裝技術(shù)在根面構(gòu)建緩釋系統(tǒng)的研究

    張弘岑 蓮?fù)艨?/p>

    目的使用疊層自組裝技術(shù)在牙根面構(gòu)建外源性蛋白緩釋系統(tǒng)。方法收集離體下頜第二前磨牙18顆,隨機(jī)分為6組,a-e組為實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)行酸蝕處理;f組為對(duì)照組,不作酸蝕處理。各組在不同條件下進(jìn)行疊層自組裝實(shí)驗(yàn),于第1~9天收集樣本液,檢測吸光度并計(jì)算蛋白釋放濃度。結(jié)果各組樣本蛋白均有持續(xù)性釋放,各組內(nèi)均呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢(P<0.05)。酸蝕處理組蛋白釋放量顯著高于對(duì)照(P<0.05);隨著原料中蛋白濃度增加,其釋放量及緩釋速率提高(P<0.05);隨吸附次數(shù)的增加,蛋白釋放量也提高(P<0.05),緩釋速率基本不變,但釋放維持時(shí)間延長。結(jié)論疊層自組裝技術(shù)能有效地在根面構(gòu)建外源性蛋白的緩釋系統(tǒng)。

    疊層自組裝技術(shù)根面處理緩釋系統(tǒng)蛋白吸附

    牙根表面覆蓋有足夠的活性牙周膜細(xì)胞是牙再植成功的關(guān)鍵[1]。研究證實(shí),根面牙周膜細(xì)胞移植可明顯改善全脫位牙再植的預(yù)后[2-4]。但細(xì)胞移植存在諸多缺點(diǎn),不利于其臨床轉(zhuǎn)化。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,通過誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢促進(jìn)組織再生修復(fù)已成為一種新的治療理念,并在多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了證實(shí)[5-7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),通過浸泡法,在延時(shí)再植的比格犬前磨牙根面加載外源性趨化因子能夠出現(xiàn)一定程度的牙周再生,但再生的成功率并不高[8]。究其原因,可能是由于牙根面很光滑,不利于外源因子的吸附,無法作為趨化因子緩釋載體。為此,本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用疊層自組裝技術(shù)(Layerby-Layer self-assembly technique,LbL)在牙根面構(gòu)建外源性蛋白質(zhì)的緩釋系統(tǒng)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

    牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、檸檬酸(生工生物工程股份有限公司),明膠(Sigma,美國),藻酸鈉(Sigma,美國)。紫外-可見吸收光譜儀(BWTEK,美國)。

    1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

    配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1和1.0mg·mL-1的BSA溶液,紫外-可見吸收光譜儀檢測,并記錄280 nm吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3 制備根片

    收集牙根大小、形態(tài)相似的離體健康下頜第二前磨牙18顆,隨機(jī)分為a~f共6個(gè)組,每組3顆。去凈牙周膜并截冠,流動(dòng)樹脂封閉根管口及根尖孔,透明指甲油封閉截面。

    1.4 配制試劑

    室溫下配制30%的新鮮檸檬酸。40℃環(huán)境下配制0.1%的明膠溶液,冷卻至室溫。室溫下配制0.1%藻酸鈉溶液,加入BSA,分別配成濃度為0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的藻酸鈉-BSA溶液。

    1.5 LbL吸附實(shí)驗(yàn)

    a~e組為實(shí)驗(yàn)組,牙根置于30%檸檬酸中,超聲環(huán)境下浸泡30 min;f組為對(duì)照組,牙根置于生理鹽水中,超聲環(huán)境下浸泡30 min。取出牙根,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次。

    各組牙根分別浸泡于10 m L 0.1%明膠溶液中,勻速震蕩10 min,PBS沖洗2次,再浸泡于10 m L不同濃度的藻酸鈉-BSA溶液中,靜置10 min,PBS沖洗2次。將此步驟記為1次LbL吸附(表1)。

    表1 樣本分組及處理方式Table.1 G rouping and treatment of the specim ens

    1.6 檢測BSA釋放量

    將上述各組牙根分別置于10 m L生理鹽水中,室溫靜置。分別于1~9 d時(shí)收集各組樣本液5 mL,即刻檢測280 nm吸光度,重復(fù)測量3次。計(jì)算累積濃度,繪制曲線圖。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)累積濃度的差異和組間處理因素的差異(根面酸蝕處理、原料BSA濃度、吸附次數(shù)以及是否包覆明膠薄膜)使用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 BSA吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

    對(duì)各濃度生理鹽水-BSA溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜儀檢測,并記錄280 nm吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

    圖1 280 nm處生理鹽水-BSA的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of absorbance of saline-BSA at 280 nm

    2.2 BSA釋放量

    測定各組各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的樣本液累積濃度,結(jié)果顯示各組樣本在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)均有持續(xù)性釋放,其中a、b、c三條曲線在6~7 d后逐漸趨于平緩,而d、e、f三條曲線到9 d時(shí)仍能保持相對(duì)恒定的釋放速率(圖2)。

    圖2 各組樣本隨時(shí)間的BSA釋放濃度均值曲線Fig.2 The average curve of BSA release concentration in each sam ple

    本實(shí)驗(yàn)各組樣本均呈現(xiàn)緩慢釋放的趨勢(P<0.05),表明疊層自組裝技術(shù)能夠有效地在牙根表面構(gòu)建外源性蛋白緩釋系統(tǒng),吸附BSA并持續(xù)性釋放。

    BSA釋放濃度均值曲線顯示,曲線d明顯高于曲線f,趨勢分析與組間差異均具有顯著差異(P<0.05),表明未經(jīng)處理的牙根表面使用LbL技術(shù)也能夠吸附上BSA,但酸蝕處理能夠顯著提高其釋放量。

    a、b、c三條曲線走勢相似,趨勢分析與組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明當(dāng)吸附次數(shù)一定(均為2次)時(shí),LbL所用原料中BSA的濃度能夠影響其釋放量,在一定范圍內(nèi)隨濃度增加,釋放量及緩釋速率也提高。

    曲線b在6~7 d后趨于平緩,而曲線d在9 d時(shí)仍然保持較為恒定的釋放速率,趨勢分析與組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明原料中BSA濃度一定時(shí),隨LbL吸附次數(shù)的增加其釋放量也提高,緩釋速率基本不變,但釋放時(shí)間延長。

    d、e兩條曲線基本重疊,趨勢分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但組間差異無顯著性(P>0.05),表明在最外層包覆明膠薄膜能夠影響各時(shí)間點(diǎn)的BSA釋放量,但不足以對(duì)整體釋放水平造成顯著性改變。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)首次將疊層自組裝技術(shù)應(yīng)用于延時(shí)再植牙的研究。該技術(shù)是一種生理多功能性納米薄膜制造技術(shù)[9],在眾多自組裝方法之中,分子沉積自組裝的應(yīng)用最為廣泛,其原理是使帶有相反電荷的材料(聚陽離子和聚陰離子)交替沉積[10],常在生物及生物材料領(lǐng)域用于攜帶藥物以達(dá)到緩釋作用。

    研究證實(shí),使用酸蝕劑對(duì)牙根面進(jìn)行酸蝕處理能暴露膠原纖維,使根面呈微孔結(jié)構(gòu)[11-12],這種微觀形貌可提高牙周細(xì)胞對(duì)根面的黏附和增殖能力[13],還可提供天然的支架結(jié)構(gòu),利于外源性因子的緩釋。此外,酸蝕處理能改善根面的生物相容性,促進(jìn)外源性因子的吸附[11-12]。常見的根面酸蝕處理劑有30%檸檬酸、24%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)和37%磷酸[14]。其中,30%檸檬酸因其有效的去污能力得到廣泛應(yīng)用[15]。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),以30%檸檬酸在超聲環(huán)境下浸泡30 min能夠簡便有效地暴露根面膠原纖維網(wǎng),故本實(shí)驗(yàn)中均采用這一方法。其作用機(jī)制可能是經(jīng)酸蝕處理的根面膠原纖維暴露,一方面增加了牙根表面面積,另一方面纖維網(wǎng)中密集的孔隙提供了聚電解質(zhì)吸附的通道,進(jìn)而提高了整個(gè)牙根對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力。

    本實(shí)驗(yàn)使用LbL技術(shù)在根面加載外源性蛋白質(zhì)并檢測其持續(xù)釋放效果。結(jié)果表明,LbL技術(shù)能夠簡便有效地在牙根表面構(gòu)建外源性蛋白的緩釋系統(tǒng),吸附BSA并達(dá)到緩釋作用,根面酸蝕處理能夠提高蛋白的釋放量,不同的組裝條件也會(huì)影響蛋白釋放情況。由于細(xì)胞因子是蛋白質(zhì)類物質(zhì),故本實(shí)驗(yàn)提供了一種在根面加載細(xì)胞因子的新型方法,但其在延時(shí)再植中的具體臨床意義還需細(xì)胞因子吸附實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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    Layer-by-layer Self-assembly Coating in the Construction of Sustained Release System on Root Surface

    ZHANG Hong1,CEN Lian2,WANG Jun1.
    1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China.Corresponding author:WANG Jun(E-mail:wangjun202@hotmail.com).

    Objective To construct a sustained release system of exogenous protein on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.M ethods Eighteen healthy mandibular second premolars were collected and randomly divided into 6 groups,group a-e were experimental groups with acid etching,group f was a control group without etching.Each group went through layer-by-layer adsorption experiments under different conditions.Samp les were collected and detected absorbance on day 1-9 in each group to calculate the concentration of protein release.Results All sets of samples showed sustained-release trend(P<0.05).Etching group showed a significant increase of protein release compared with control group(P<0.05);Release rate and amount increased with the protein concentration in the materials(P<0.05); More adsorption times leaded to larger release amount and prolonged time(P<0.05).Conclusion Sustained release system of exogenous protein can be constructed on the root surface using layer-by layer self-assembly coating technique.

    Layer-by-Layer;Root surface conditioning;Sustained release system;Protein absorption

    Q813.1+2

    A

    1673-0364(2015)03-0121-03

    10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.001

    2015年4月3日;

    2015年5月11日)

    上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目(124119b0101)。

    200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒童口腔科(張弘,汪俊);200237上海市華東理工大學(xué)化工學(xué)院(岑蓮)。

    汪?。‥-mail:wangjun202@hotmail.com)。

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