西藏小型豬MSTN基因分子克隆及序列分析

吳清洪，岳 敏，田雨光，2，王玉玨，徐名襯，顧為望，2

(1．南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510515;2．東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司，廣東東莞 523808)

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)又稱GDF- β(growth differentiation factor β)，是生長轉(zhuǎn)化因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族的新成員［1－4］。MSTN 在骨骼肌中特異性表達(dá)，對肌肉生長有負(fù)調(diào)控作用，研究表明，該基因的突變在肉牛中會造成骨骼肌異常肥大［5］。通過抑制MSTN活性而增加肌肉量，在豬的分子育種具有潛在的應(yīng)用價值。因此，該基因被發(fā)現(xiàn)后短短幾年之內(nèi)很多物種的MSTN基因得到克隆、測序和定位［6－8］。

喬憲鳳等［9］在2010年就以湖北白豬背最長肌肌細(xì)胞總RNA為模版，利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出湖北白豬的MSTN基因的cDNA片段，其測序結(jié)果與報道的一致。西藏小型豬是2004年南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心從西藏工布江達(dá)縣引入純種的45頭西藏小型豬，作為實驗動物進(jìn)行封閉群管理［10］。目前已完成風(fēng)土馴化及實驗動物化研究，并開展了相關(guān)動物模型、藥物實驗及轉(zhuǎn)基因克隆等研究。從免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該品系具有獨特的免疫相關(guān)指標(biāo)和遺傳特征，加上其獨特的外形，是一種優(yōu)良的實驗用小型豬品種［11－13］。研究西藏小型豬的MSTN基因，可為進(jìn)一步開展西藏小型豬分子育種技術(shù)研究等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:西藏小型豬6月齡1頭，來源于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK(粵)2011-0074】，取其肝臟，液氮速凍，－80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒(No．DP419)、質(zhì)粒小提試劑盒(No．DP103)、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(No．CB101)購自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScript RT reagent Kit(No．DRR037A)、EX Taq(No．DR001A)、pMD19-T Vector(No．D102A)、HindIII內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自廣東省東盛生物科技有限公司;DM2000購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

使用天根公司的RNA提取試劑盒提取肝臟組織的總RNA。組織從－80℃冰箱中取出來，用液氮冷卻研磨成粉末，倒入去RNA酶的1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打室溫靜置5 min，按照試劑盒說明按步驟提取。利用核酸蛋白濃度測定儀Nano Drop 2000測RNA濃度及純度(OD260/OD280)，余下樣品－20℃保存。

1.2.2 cDNA合成

使用寶生物公司的PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成按下列組份配制RT反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)。5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL，Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1 μL，Total RNA 1 μg，RNase Free dH2O加至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR引物的設(shè)計和合成

根據(jù)GenBank中豬MSTN基因的序列(Gene Accession No．:NM_214435)，運用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計特異性引物，由Invitrogen公司合成。引物為:Up(P1):5’-ATGCAAAAACTGCAAATCTA TGTTTATATTTAC-3’，Down(P2):5’-TCATGAGCA CCCACAGCGATCTAC-3’

1.2.4 PCR擴(kuò)增

在PCR反應(yīng)管中配置25 μL的反應(yīng)體系，模板量為0.5 μL豬cDNA擴(kuò)增MSTN。25 μL的反應(yīng)體系為 2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL，10 × Ex Taq buffer 2.5 μL，模板 cDNA 0.5 μL，引物 P1 2.5 μL，引物 P2 2.5 μL，ExTaq 0.3 μL，ddH2O 14.6 μL。擴(kuò)增條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，32個循環(huán);72℃ 5 min;16℃保存。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的回收純化

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，在紫外條件下，手術(shù)刀切取含目的片段的凝膠條帶至干凈1.5 mLEP管中，利用廣東東盛生物科技有限公司的DNA凝膠回收試劑盒純化目的片段，純化產(chǎn)物中一部分直接測序，一部分進(jìn)行克隆測序。

1.2.6 目的片段與載體連接

將純化的目的片段與pMD19-T載體進(jìn)行連接，反應(yīng)體系 10 μL:1 μL pMD19-T Vetor，2 μL 回收的PCR 產(chǎn)物，5 μL SolutionI，2 μL ddH2O。恒溫循環(huán)水浴16℃連接2 h。

1.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和培養(yǎng)

冰浴中將6 μL連接產(chǎn)物加入至30 μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30 min，42℃水浴熱休克90 s，再冰浴 2 min。分別加入 200 μL LB 培養(yǎng)基(Amp－)，混勻，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 1 h，將菌液涂布與含氨芐青霉素(Amp+100 μg/mL)的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉(zhuǎn)移至37℃生化培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)1 h后，倒置過夜培養(yǎng)。

1.2.8 質(zhì)粒的酶切鑒定陽性克隆

從平板上面各接種若干菌落于3 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp+)的15 mL離心管中200 r/min，37℃搖床過夜培養(yǎng)。使用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系為10 μL:4 μL的提取質(zhì)粒，10 × M Buffer 1 μL，HindIII 0.4 μL、EcoRI0.4 μL。37℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像。陽性菌液送金唯智基因公司測序。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

從西藏小型豬肝臟組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板，以特異性引物擴(kuò)增到了1152 bp長的片段，與預(yù)期相符(圖1)。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 The electrophoresis of RT-PCR amplification

2.2 重組質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果

將西藏小型豬的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，插入到pMD19-T載體的外源基因插入位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)HindIII內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶雙酶切(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒和酶切鑒定圖Fig．2 Identification of recombinant plasmid by digested(HindIII+EcoRI)and plasmid

2.3 西藏小型豬MSTN基因序列分析和比對

利用DNAman、Lasergene等多個生物信息學(xué)軟件由西藏小型豬MSTN cDNA序列可以獲得編碼的375氨基酸(圖 3)。與 NCBI網(wǎng)站(http://www．ncbi．nlm．nih．gov)BLAST 后 下 載 的 人(NM005259.2)、小 鼠 (NM010834)、大 鼠(NM019151)、山 羊 (HM462261)、黑 猩 猩(NM001079919)、 牛 (GQ184147)、 綿 羊(NM001009428.1)、犬(NM001002959)、版納微型豬 (JN630464)、 馬 (NM001081817)、 雞(NM001001461)11個物種的氨基酸序列進(jìn)行比對，相似性分別為95%、92%、91%、95%、95%、94%、94% 、93% 、99% 、97% 、85% 。

圖3 西藏小型豬MSTN基因推導(dǎo)蛋白氨基酸序列Fig．3 The putative amino acid sequence of MSTN gene of Tibet mini-pigs

2.4 西藏小型豬MSTN進(jìn)化樹

利用Mega6.0軟件將西藏小型豬的MSTN氨基酸序列與人、小鼠、大鼠、山羊、黑猩猩、牛、綿羊、犬、版納微型豬、馬、雞、斑馬魚12個物種的MSTN氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，西藏小型豬MSTN基因除了與雞和斑馬魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)外，與其他10個物種較為接近，其中與版納微型豬的親緣關(guān)系最為接近。

圖4 MSTN分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．4 The phylogenetic tree of MSTN protein

3 討論

1997年，McPherron等通過篩選小鼠的骨骼肌cDNA文庫而得到全長的cDNA序列。分析表明，小鼠Myostatin cDNA序列中只有一個開放閱讀框架(opening reading frame，ORF)，編碼 376個氨基酸，具有TGF-β超家族的典型結(jié)構(gòu)，但與其它TGF-β家族成員的同源性很低，因而被為新一類:GDF-8(growth-differentiation factor 8)。研究表明，GDF-8前肽C-末端區(qū)域?qū)ζ涔δ艿姆€(wěn)定性具有重要的作用，抑制性區(qū)域位于氨基酸42～115之間［14－16］。國外Lee及其同事Daneau等［17］都報道了豬肌生成抑制素基因的cDNA序列，綜合兩者的結(jié)果，已得到1756 bp的豬肌生成抑制素cDNA序列，其中1～1125 bp編碼氨基酸序列，表明豬肌生成抑制素前體由375個氨基酸組成。本研究通過對西藏小型豬的MSTN基因的cDNA序列進(jìn)行了克隆測序，發(fā)現(xiàn)MSTN基因編碼區(qū)全長 1128 bp，利用 DNAman、Lasergene等多個生物信息學(xué)軟件由西藏小型豬MSTN cDNA序列可以獲得編碼的375氨基酸。與版納微型豬進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)在307位的氨基酸由N→S。

在與人、小鼠、大鼠、山羊、黑猩猩、牛、綿羊、犬、版納微型豬、馬、雞11個物種的氨基酸序列進(jìn)行比對，相似性分別為 95%、92%、91%、95%、95%、94%、94%、93%、99%、97%、85%，發(fā)現(xiàn)西藏小型豬與版納微型豬的相似性最高，達(dá)99%。與人、山羊、黑猩猩、馬相應(yīng)序列同源性都超過了94%。表明西藏小型豬與11個物種間在該基因編碼區(qū)核苷酸序列間具有較高的保守性。

分子系統(tǒng)進(jìn)化樹表明MSTN基因西藏小型豬除了與雞和斑馬魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)外，與人、犬、版納微型豬、綿羊、山羊、牛、馬、黑猩猩、大鼠、小鼠的關(guān)系都較為接近，其中與版納微型豬的親緣關(guān)系最為接近，這也更進(jìn)一步說明了西藏小型豬與版納微型豬是親緣關(guān)系較近的兩個豬種，只是在該基因核苷酸和氨基酸水平上有很小差異，說明了西藏小型豬與版納小型豬起源及進(jìn)化程度有所不同，它們在DNA水平上有極小的差異，這也為進(jìn)一步開展西藏小型豬分子育種技術(shù)研究等提供了理論依據(jù)。

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