模式生物線蟲在藥物復(fù)雜體系活性評價(jià)中的應(yīng)用

王欣佩，余 煊，雷 帆，邢東明，杜力軍

(清華大學(xué)蛋白質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥物藥理實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

秀麗隱桿狀線蟲，Caenorhabditis elegans(C．elegans)，屬于線形動(dòng)物門、線蟲綱。線蟲廣泛的分布在土壤中，以細(xì)菌為食，能夠感知?dú)馕?、光線、溫度以及機(jī)械刺激。早在20世紀(jì)60年代初期，科學(xué)家Sdyney Brenner就將線蟲(C．elegans)引入到發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的研究中［1］。隨后，在90年代中期，科學(xué)家 John E．Sulston［2－4］利用微分干涉顯微鏡(DIC)繪制線蟲的細(xì)胞譜系，揭示了雌雄同體線蟲全部細(xì)胞的命運(yùn)，促進(jìn)線蟲在單細(xì)胞水平上的深入研究。1998 年，Craig Mello 和 Andrew Fire［5］在線蟲上發(fā)現(xiàn)了dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，為線蟲基因功能的研究奠定了重要基礎(chǔ)。1998年底，線蟲的全基因組序列在Science上發(fā)表，線蟲成為了第一個(gè)完成全基因組測序的多細(xì)胞真核生物［6］。目前，線蟲作為模式生物，已經(jīng)被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域的生物學(xué)研究，包括遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、衰老調(diào)控機(jī)制、性別決定、藥物作用等［7］。本文從藥物作用角度討論了線蟲作為模式生物特點(diǎn)，以及利用線蟲作為模式生物在藥物研究方面的應(yīng)用。

1 線蟲的構(gòu)成特點(diǎn)

線蟲是一類多細(xì)胞生物，其幼蟲含有556個(gè)體細(xì)胞和2個(gè)原始生殖細(xì)胞。發(fā)育成熟的雌雄同體線蟲含有959個(gè)體細(xì)胞和2000個(gè)生殖細(xì)胞，而發(fā)育成熟的雄性成蟲僅有1031個(gè)體細(xì)胞和1000個(gè)生殖細(xì)胞。盡管線蟲是一種簡單的模式生物，但是它具有精密的結(jié)構(gòu)器官，包括肌肉、表皮、腸、生殖系統(tǒng)、腺體以及由302個(gè)(雌雄同體成蟲)或391個(gè)(雄蟲)神經(jīng)元組成的神經(jīng)系統(tǒng)。

2 線蟲作為模式生物的優(yōu)勢

線蟲以大腸桿菌(Escherichia coli，E．Coli)OP50為食，既可以養(yǎng)于瓊脂培養(yǎng)板，還可以養(yǎng)于液體培養(yǎng)基［8］。線蟲成蟲體長僅1.3 mm左右，對成長空間的需求較小，96孔板的一個(gè)孔內(nèi)即可培養(yǎng)100條線蟲［9］。在實(shí)驗(yàn)室條件下易于大量培養(yǎng)、繁殖。此外，與細(xì)菌、細(xì)胞一樣，線蟲可以在液氮或－80℃冰箱中長期冷凍保存［1］。線蟲身體透明，在普通顯微鏡下下易于觀察其體內(nèi)結(jié)構(gòu)及生長發(fā)育過程。此外，還可以通過體內(nèi)熒光標(biāo)記，利用熒光顯微鏡直觀地追蹤某些生物過程，如軸突生長、胚胎發(fā)生、脂肪代謝等［10］。線蟲的生長和繁殖速度很快，其生長發(fā)育速度受生長環(huán)境溫度的調(diào)控。在25℃培養(yǎng)條件下，從蟲卵長至成蟲需要2.5 d。20℃培養(yǎng)條件下，需要3.5 d發(fā)育為成蟲。15℃培養(yǎng)條件下，則需要6 d才能發(fā)育為成蟲。在最適培養(yǎng)溫度(20℃)下，成蟲的繁殖能力最強(qiáng)，通過自體受精，一次可以產(chǎn)生300多個(gè)后代［11］。線蟲具有5對常染色體和1對性染色體，遺傳背景簡單。線蟲的全基因組測序早在1998年業(yè)已完成。目前，已建成多個(gè)數(shù)據(jù)平臺，如worm base、worm book實(shí)現(xiàn)了遺傳信息的共享。2000年，Arhinger實(shí)驗(yàn)室完成了線蟲全基因組的RNAi文庫，使得線蟲成了第一個(gè)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行功能缺失分析的多細(xì)胞生物。

3 人類基因和線蟲基因間的保守性

在線蟲中建立人類疾病的模型的一個(gè)重要依據(jù)是藥物靶點(diǎn)在兩個(gè)物種之間是否具一定的保守性。通過生物信息學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)60% ～80%的人類基因在線蟲體內(nèi)都具有同源直系物［12］。除了同源基因外，目前還發(fā)現(xiàn)許多重要的信號通路在線蟲和人類中也具有一定的保守性，如細(xì)胞增殖相關(guān)的RAS 信號［13］、Wnt信號［14］，免疫相關(guān)的 TGF-β 信號、Toll信號、MAPK 信號［15－17］。

根據(jù)Ortho Disease數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，在2，466個(gè)人類疾病相關(guān)基因中，小鼠中有1，354個(gè)同源基因，果蠅有724個(gè)，線蟲有533個(gè)，大腸桿菌中有153個(gè)［18］。在眾多模式生物中，選擇大鼠、小鼠、靈長類等作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效率低下、實(shí)驗(yàn)成本昂貴、可操作性有限的局面。選擇細(xì)菌、酵母、體外細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)又可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人類疾病相關(guān)性差的結(jié)果。相比之下，利用線蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是一個(gè)快速的、有效的、經(jīng)濟(jì)的、高通量技術(shù)。我們可以基于一個(gè)完整的生命體進(jìn)行系統(tǒng)研究，而非僅僅局限于藥物對某個(gè)細(xì)胞系或某個(gè)受體蛋白的作用。

4 線蟲在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

4.1 人類疾病在線蟲中的模型建立

利用線蟲進(jìn)行藥物篩選的第一步就是建立人類疾病的線蟲模型，包括確定疾病相關(guān)基因在線蟲體內(nèi)的同源基因，了解同源基因在線蟲體內(nèi)的相關(guān)功能。一般來說，有三種方式可以建立人類疾病的線蟲模型:1)敲除(突變體)、敲低(RNAi)或增強(qiáng)線蟲中人類疾病相關(guān)基因的同源直系基因并考察該基因?qū)Ρ硇偷挠绊?，即建立突變體模型。2)通過藥物或化合物誘導(dǎo)，線蟲中建立一個(gè)與疾病相關(guān)或相似的生物過程，即化學(xué)誘導(dǎo)模型。3)在線蟲中表達(dá)人類基因并產(chǎn)生一些疾病相關(guān)的表型，即建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。

4.2 人類疾病的線蟲模型

糖尿病模型:線蟲體內(nèi)daf-2基因與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的胰島素樣生長因子IGFs受體家族同源，該基因調(diào)控了線蟲的代謝、生長及壽命［19］。DevGen公司通過daf-2基因突變株建立了2型糖尿病藥物高通量篩選的線蟲模型。目前己從insulin信號通路對相關(guān)藥物進(jìn)行篩選研究［20］。

衰老模型:常用的線蟲衰老模型有daf-2突變株、daf-16突變株以及原始野生型N2［21］。daf-2基因突變導(dǎo)致DAF-2受體型酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)變異，相比野生型該突變株的壽命更長。daf-16作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)體內(nèi)壽命相關(guān)基因的表達(dá)，daf-16的突變導(dǎo)致線蟲的壽命比N2野生株短。利用線蟲模型，高通量的篩選抗衰老藥物已經(jīng)有近30年的歷史，并取得了豐碩的研究成果。

阿爾茲海默癥(AD)模型:將人源β-淀粉樣蛋白轉(zhuǎn)入線蟲中異源表達(dá)，建立AD的轉(zhuǎn)基因線蟲模型。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因模型中可以誘導(dǎo)產(chǎn)生淀粉樣蛋白沉淀物，并引起線蟲麻痹。該轉(zhuǎn)基因模型可以有效的用于β-淀粉樣蛋白抑制劑的高通量篩選［22］。

帕金森病模型:包括通過異源過表達(dá)人α-突觸核蛋白建立轉(zhuǎn)基因模型［23］和通過神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)建立藥物誘導(dǎo)模型［24］，兩種模型分別導(dǎo)致線蟲神經(jīng)元的損傷和多巴胺能神經(jīng)元的選擇性凋亡。此外還有氧化應(yīng)激及其金屬離子失紊態(tài)相關(guān)模型［25］。

亨廷頓病模型:通過注射人源亨廷頓蛋白N末端基因建立轉(zhuǎn)基因模型，導(dǎo)致線蟲的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并且，隨著時(shí)間的延長，神經(jīng)細(xì)胞蛋白沉積增多［26］。目前，使用此模型篩選到的光輝霉素和氯化鋰已經(jīng)經(jīng)過FDA批準(zhǔn)，成為治療該疾病的有效藥物［12］。

線蟲的抑郁模型:MOD-5是哺乳動(dòng)物中血清素重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)的同源直系物，通過抗抑郁藥物氟西汀阻斷MOD-5可以建立線蟲的化學(xué)誘變模型。氟西汀作用于MOD-5后，可以增加突觸前5-羥色胺的濃度，刺激線蟲進(jìn)食行為，并增加排卵量。而在MOD-5突變體中，氟西汀的這種作用消失。通過該模型，確定了抗抑郁藥物氟西汀的作用靶點(diǎn)就是SERT，并且證明線蟲模型也能夠用于抗抑郁藥物的篩選［27］。

抗菌模型:線蟲還經(jīng)常被用于宿主-病原體的研究中。線蟲可以被一些病原體殺死，如假單胞菌、粘質(zhì)沙雷菌、腸炎沙門菌亞屬、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等。由于，宿主-編碼的防御系統(tǒng)在進(jìn)化上是保守的，因此涉及其中的有害機(jī)制可以用于研究涉及這些病原體的人類疾?。?8］。

除此之外，近年來線蟲還被應(yīng)用到多個(gè)生理系統(tǒng)疾病的研究中，例如:癌癥及其抗癌藥物，空間障礙及衰老，酒精成癮，空氣微粒體毒性等［29－32］。

5 線蟲在藥物作用研究中的應(yīng)用

盡管線蟲是一個(gè)簡單的模式生物，但是它具有精密完善的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。如圖1［38］所示，藥物作用于線蟲時(shí)，首先，藥物需要進(jìn)入線蟲體內(nèi)(通過皮膚擴(kuò)散，或通過攝取進(jìn)入腸腔)。藥物需要為生物體可用的，才能夠穿過腸細(xì)胞膜并到達(dá)靶組織。到達(dá)靶向位置后，藥物需要作用于其初始靶點(diǎn)，并克服胞內(nèi)和組織內(nèi)的自身調(diào)節(jié)，發(fā)揮藥效。換句話說，只有在體內(nèi)具有活性的物質(zhì)才能在線蟲體內(nèi)引發(fā)反應(yīng)。因此，利用線蟲進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可以用于藥物對其作用靶點(diǎn)機(jī)制的研究，以及增加對藥物對多個(gè)靶點(diǎn)協(xié)同作用的研究。目前，基于線蟲的藥物作用靶點(diǎn)研究方法主要有以下兩類:

正向遺傳學(xué)(forward genetics):正向遺傳學(xué)是一個(gè)從表型到基因型的基本研究策略。正向遺傳學(xué)的基礎(chǔ)是通過誘變劑誘導(dǎo)線蟲DNA的隨機(jī)突變，篩選預(yù)期表型的突變體，通過單核苷酸多態(tài)性(SNP)等方法對突變基因的染色體進(jìn)行定位，并獲得突變基因的序列，從而確定表型和基因型的關(guān)系。這種研究方法可以檢測突變體對某個(gè)藥物/化合物的是否有超敏或脫敏的現(xiàn)象，從而探索藥物的作用機(jī)制以及作用靶點(diǎn)?？挂钟羲幬锓魍〉淖饔冒悬c(diǎn)就是利用MOD-5(人類血清素重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體的同源基因)突變體對氟西汀作用脫敏的現(xiàn)象，確定MOD-5是氟西汀的一個(gè)作用靶點(diǎn)，并由此推斷人類SERT基因可能是氟西汀治療抑郁的重要靶點(diǎn)。

圖1 藥物進(jìn)入線蟲體內(nèi)的路徑Fig．1 Drug entry route into C．elegans

反向遺傳學(xué)(reverse genetics):與正向遺傳學(xué)相反，反向遺傳學(xué)是從基因型到表型的研究策略。反向遺傳學(xué)的基礎(chǔ)是觀察某個(gè)基因失活后生物體表型的變化。常用的反向遺傳學(xué)方法有:一是根據(jù)研究需求，建立不同基因的突變體［33］。根據(jù)Caenorhabditis Genetics Center(CGC)的記錄，目前CGC已經(jīng)保存并可以提供1萬多種線蟲的突變體，包括有人類疾病基因同源基因的突變體線蟲，以及同一基因的多種突變體。根據(jù)研究的需要，選擇不同的突變體，即可考察該突變基因的功能以及確定藥物的作用靶點(diǎn)。另一類反向遺傳學(xué)的研究方法是RNA干擾(RNAi)，RNAi是一個(gè)在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象，用于降低目標(biāo)基因的表達(dá)。RNAi介導(dǎo)的基因敲除操作簡單，可以通過直接將線蟲浸潤在含有dsRNA的溶液或者用可以產(chǎn)生dsDNA的細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲。在線蟲中導(dǎo)入RNAi需要至少100 bp長的dsRNA。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，只有短于22個(gè)核苷酸的dsRNA(通常成為small interfering RNA，siRNA)分子可以使用，以免引起干擾素反應(yīng)或非特異性的抑制蛋白質(zhì)生成。這兩種副反應(yīng)在線蟲體內(nèi)都是不存在的。線蟲對長鏈dsRNA的兼容性可以通過作用于靶基因的多個(gè)位點(diǎn)來提高RNAi的效率。當(dāng)線蟲暴露于dsRNA后，靶基因的表達(dá)很快被降低，導(dǎo)致線蟲出現(xiàn)新的表型。這一過程的發(fā)生需要多少時(shí)間，取決于不同的靶基因以及編碼蛋白的周轉(zhuǎn)率。RNAi可以在線蟲的任意生命周期中被導(dǎo)入，并且可以通過持續(xù)的使用可以產(chǎn)生相關(guān)dsRNA的細(xì)菌喂養(yǎng)線蟲來將RNAi誘導(dǎo)的表型維持很多代。由于在線蟲上做RNAi實(shí)驗(yàn)操作簡單，并且已經(jīng)有豐富基因組數(shù)據(jù)做支持，這促進(jìn)了一個(gè)新的高通量的方法，即全基因組RNA干擾(genome-wide RNAi)。在藥物作用機(jī)制的研究中，我們可以使用線蟲，在完整的生命體中進(jìn)行藥物靶點(diǎn)的自動(dòng)化/半自動(dòng)化高效篩選。

6 線蟲在中藥提取物藥理作用研究中的應(yīng)用

中藥及其中藥復(fù)方制劑以其成分復(fù)雜、作用全面等特點(diǎn)而不同于西藥，以“多成分、多靶點(diǎn)”而凸顯自己的優(yōu)勢。同時(shí)也正是由于復(fù)方提取物的復(fù)雜性且只能口服給藥，并進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，制約了對其作用機(jī)制的研究。分子機(jī)制研究須依賴于細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，但中藥提取物體外給藥難以排除非特異性成分的影響，由此而使研究進(jìn)入到兩難境地。

“血清藥理學(xué)”方法就是為了使中藥提取物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)而產(chǎn)生的。旨在利用胃腸作為過濾屏障，直接采集口服中藥提取物后的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以此來探討其藥物的作用機(jī)制。但是這一技術(shù)有兩個(gè)不足:一是對血清含藥量不易控制;二是對所含藥物成分不清。如此影響了其后續(xù)機(jī)制的深入探討和對研究結(jié)果的準(zhǔn)確判定。線蟲是獨(dú)立的個(gè)體，且體內(nèi)結(jié)構(gòu)簡單，易于觀察。因此，在施以中藥提取物的同時(shí)，就可以直接檢測體內(nèi)的分子水平的變化。即保證了中藥提取物的復(fù)雜特性，同時(shí)又利于對其作用的觀察和研究，是一個(gè)較為理想的模式生物。例如，我們可以利用分子生物技術(shù)構(gòu)建相關(guān)靶標(biāo)蛋白熒光表達(dá)的轉(zhuǎn)基因線蟲模型，通過其熒光蛋白表達(dá)與否可以直接觀察到受試中藥的靶標(biāo)作用。這是一種較為理想的研究中藥的技術(shù)。目前，國內(nèi)以線蟲來觀察研究中藥提取物的工作開展得還十分有限，大多集中在對中藥安全性及其抗衰老延長線蟲壽命等方面［34－36］，關(guān)于線蟲在中藥研究中的優(yōu)勢也有一定的探討［37］。未來，關(guān)于線蟲在中藥提取物中的研究方法學(xué)的考察及其對該技術(shù)的特點(diǎn)和規(guī)律的研究等有待于加強(qiáng)。

7 小結(jié)

在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，我們對模式生物線蟲的研究已經(jīng)積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn)，并取得了卓越的科研成果。然而我們也必須認(rèn)識到線蟲作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型也有一定局限性:首先，線蟲作為一個(gè)無脊椎低等生物，我們很難保證在藥物在線蟲模型和人體中具有一致的安全性和有效性。其次，線蟲的身體結(jié)構(gòu)簡單，沒有心臟、呼吸系統(tǒng)、特異免疫系統(tǒng)，因此有一些人類疾病很難在線蟲中建立疾病模型。由于線蟲和人類的種間差距較大，線蟲模型不適用于藥物安全性評價(jià)或某些特定疾病的相關(guān)研究，但是，這并不代表線蟲模型不能用于藥物研究。事實(shí)上，在藥物的早期研究中，線蟲迅速提供一些基礎(chǔ)機(jī)制的線索，如某個(gè)特定基因的功能或藥物的某個(gè)靶點(diǎn)。特別是當(dāng)確定了某個(gè)疾病的分子基礎(chǔ)后，可以針對某一靶點(diǎn)利用線蟲進(jìn)行藥物的高通量快速篩查。線蟲模型最重要的意義在于，線蟲搭起了體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)和體外(in vitro)實(shí)驗(yàn)中間的橋梁，在整體動(dòng)物水平實(shí)現(xiàn)了高通量的、可靠的實(shí)驗(yàn)研究。這一點(diǎn)也是中藥提取物研究的最理想之處。

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