紫花苜蓿根響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析

熊軍波 楊青川 蔡化 田宏 張鶴山 劉洋

摘要：6 d齡紫花苜蓿（Medicago sativa L.）幼苗在0、200 mmol/L NaCl處理9 d后，采用雙向電泳分別分離了其根部蛋白組。最終每塊膠中有超過900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被分離，采用MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合MASCOT軟件在線檢索，成功鑒定21個(gè)表達(dá)量發(fā)生1.5倍以上變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)，為19種不同的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與脅迫防御、碳水化合物和能量代謝、次生代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等調(diào)控途徑。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；鹽脅迫；根；蛋白質(zhì)組

中圖分類號(hào)：S551+.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5422-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.057

Comparative Proteomic Analysis of Salt-stress Response of Alfalfa Proteins in Root

XIONG Jun-bo1，YANG Qing-chuan2，CAI Hua1，TIAN Hong1，ZHANG He-shan1，LIU Yang1

（1.Institute of Animal Science， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 431700， China；2.Institute of Animal Science of Beijing， Chinese Academy of Agricultural Science， Beijing 100194， China）

Abstract： 6 day old alfalfa （Medicago sativa L.） seedlings were exposed to 0（control），and 200 mmol/L NaCl for 9 days. Proteins extracted from the root of alfalfa seedlings were separated by two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）. More than 900 protein spots were detected on each gel，and 21 spots at least one point five-fold differences in abundance were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-TOF/MS） and MASCOT online. Bioinformatics analysis induced that these proteins were associated with a variety of functions，including stress defense，carbohydrate and energy metabolism，secondary metabolism，transcription and translation related，signaling and ion transport.

Key words：alfalfa（Medicago sativa L.）； salt-stress；root； proteomic

根據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization）的估算，全世界約有3 400萬hm2（灌溉面積的11%）受到不同程度的鹽漬化影響[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部組織的第二次全國土壤普查資料統(tǒng)計(jì)，我國現(xiàn)有鹽漬土的面積為0.35億hm2（不包括濱海灘涂），其中已開墾種植的為576.84萬hm2。鹽漬化土壤中高濃度的鹽離子會(huì)對(duì)植物的正常生理代謝產(chǎn)生影響，如水分缺失、離子毒害、營養(yǎng)失衡、氧化脅迫等，從而導(dǎo)致植物生長減緩，甚至死亡[2]。土壤鹽漬化大大限制了作物生產(chǎn)，威脅到糧食安全，研究作物抗鹽機(jī)制，提高作物抗鹽能力，是全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界上栽培種植利用最為廣泛的人工牧草，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱。紫花苜蓿屬于中等耐鹽堿植物，在電導(dǎo)率范圍為2.0 dS/m和滲透壓在1.5 bars內(nèi)的土壤中能正常生長，超過此范圍，電導(dǎo)率每上升一個(gè)單位，產(chǎn)量下降7%[3]。生理生化研究表明，紫花苜?？梢酝ㄟ^改變外在形態(tài)、加強(qiáng)活性氧脅迫保護(hù)、合成滲透物、離子選擇吸收、隔離和外排、改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等措施以適應(yīng)鹽脅迫[4]。這些適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制與鹽脅迫下紫花苜?；蚓W(wǎng)絡(luò)的特異性表達(dá)密切相關(guān)，采用各種高通量技術(shù)，已鑒定出大量鹽脅迫響應(yīng)基因[5，6]。然而，這些研究都是基于轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)來尋找脅迫應(yīng)答基因，mRNA只是基因行使功能的中間載體，而蛋白質(zhì)才是執(zhí)行各種生命活動(dòng)的主體，且研究表明，蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和mRNA水平間相關(guān)性不強(qiáng)，因此有必要從蛋白質(zhì)水平對(duì)紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究。近年來，國內(nèi)外研究者采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)超過34種植物的抗鹽脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究，并成功鑒定出大量鹽脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)[7]。根系是植物感受多種脅迫傷害的最初位點(diǎn)，對(duì)根系響應(yīng)鹽脅迫的研究有助于更深入地了解鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究以紫花苜蓿根系為研究對(duì)象，對(duì)根響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，以期更深入地揭示紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿“中苜一號(hào)”種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所牧草研究室提供。挑選籽粒飽滿、無病蟲害種子，用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用蒸餾水沖洗3次。清洗的種子用蒸餾水浸種12 h后，放置于濕潤的濾紙中培養(yǎng)3 d。之后將幼苗移入1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行水培，6 d后開始脅迫。將培養(yǎng)的幼苗分為兩組：一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)；另一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加50 mmol/L NaCl適應(yīng)生長24 h，其后放入終濃度為200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)液，期間不定時(shí)攪拌，培養(yǎng)9 d后同時(shí)收割兩組苜蓿根部，液氮保存。

1.2 藥品與試劑

固相pH 梯度干膠條（pH 4-7）、IPG buffer、2D clean-up試劑盒、2D-Quant試劑盒、尿素（Urea）、甘氨酸、CHAPS、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、過硫酸銨（AP）、甘油（glycerol），干膠條覆蓋液，均購至Amersham Biosciences公司；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇（DTT）、四甲基乙二胺（TEMED）購自Sigma公司；溴酚藍(lán)、蛋白Marker、碳酸鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉（SDS）、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自BBI（Bio Basic Inc，加拿大）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli-Q制備的純水配制。

1.3 總蛋白質(zhì)的提取和定量

蛋白質(zhì)提取方法參照文獻(xiàn)[8]，部分進(jìn)行調(diào)整。稱取0.5 g樣品液氮研磨后，轉(zhuǎn)入離心管加入3 mL TRIzol （2% DTT）， 振蕩混勻，添加0.6 mL氯仿，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃，15 000 r/min離心10 min，去上清，添加0.9 mL無水乙醇，振蕩混勻，放置5 min；4 ℃，15 000 r/min，離心5 min，取上清，加入4.5 mL異丙醇，振蕩混勻，4 ℃放置5 min；此后4 ℃，15 000 r/min離心10 min，去溶液，用6 mL含300 mmol/L鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉淀3次；4 ℃，15 000 r/min離心10 min，留沉淀，用6 mL無水乙醇洗滌一次，冷凍干燥。其后加入裂解液[8Murea， 2% CHAPS（W/V），1%DTT（W/V），0.5% IPG buffer（V/V）（pH 4～7） 和 0.002% Bromophenol blue（W/V）]，超聲20 min促溶，4 ℃靜置4 h以上，離心沉淀（4 ℃，40 000 r/min，1 h），吸取上清備用。使用Amersham公司2D-Quant試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 等電聚焦電泳和SDS-PAGE電泳

使用水化液[8Murea，2% CHAPS（W/V），1%DTT（W/V），0.5%IPG buffe（V/V）（pH 4～7）和0.002% Bromophenol blue（W/V）]稀釋蛋白質(zhì)溶液，最終將120 mg/450 mL蛋白質(zhì)溶液上樣到24 cm pH 4～7 IPG膠條上。等電聚焦在Ettan IPGphor II （GE Healthcare）儀器上進(jìn)行，溫度設(shè)置為20 ℃，程序?yàn)椋?0 V，12 h；150 V，1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000 Vh 到 40 000 Vh。等電聚焦后膠條立即平衡，首先在含有平衡液[6 mol/L urea， 30% glycerol（W/V），2%SDS（W/V），50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，1% DTT（W/V）]的平衡液管中水平放置15 min，其后換入含有平衡液的管中水平放置15 min。平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行二向分離，首先在電泳液[250 mmol/L Tris-base，1.92 mol/L glycine和1% SDS（W/V）]中0.2 W/strip運(yùn)行1 h，其后相同環(huán)境中使用15 W/strip運(yùn)行到結(jié)束。每組試驗(yàn)設(shè)置4次組內(nèi)重復(fù)。

1.5 蛋白染色和圖像分析

凝膠選用銀染，方法參照GE handbook 做適當(dāng)修改。凝膠首先在含有40%乙醇，10%乙酸的水溶液中固定1 h，其后使用含有30%乙醇，0.2%硫代硫酸鈉（W/V）和6.8%乙酸鈉溶液中敏化30 min。經(jīng)超純水漂洗3次，每次5 min；后轉(zhuǎn)入含有2.5 g/L的硝酸銀溶液中銀染20 min，其后使用超純水漂洗2次，每次1 min；轉(zhuǎn)入顯色液（25 g/L 碳酸鈉，240 ml/L 甲醛）中顯色2次，第1次1 min，第2次4 min。反應(yīng)完后轉(zhuǎn)入含有1.46%的EDTA溶液中10 min終止反應(yīng)，最后使用純水漂洗3次，每次5 min。染色完成的膠用Powerlook 2100XL掃描儀掃描，并使用ImageMasterTM 2D Platinum 6.0軟件分析，包括凝膠圖像的背景消除、點(diǎn)確認(rèn)、定量和點(diǎn)的匹配等，選取蛋白質(zhì)差異達(dá)1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.6 蛋白質(zhì)譜鑒定和分類分析

根據(jù)ImageMaste分析軟件結(jié)果挖取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，委托北京華大基因公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF/MS）分析。將所得到的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)運(yùn)用MASCOT軟件進(jìn)行在線檢索（http：//www.matrixscience.com），選取NCBI數(shù)據(jù)庫作為檢索數(shù)據(jù)庫。鑒定成功的蛋白質(zhì)點(diǎn)根據(jù)aimGo數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）功能注釋進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙向電泳凝膠圖譜分析和質(zhì)譜鑒定

分別提取對(duì)照組和處理組紫花苜蓿根部蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，經(jīng)銀染后最終電泳圖譜見圖1?；贗mageMaster圖像軟件分析表明，對(duì)照組凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)有（957±35）個(gè)，而處理組（200 mmol/L NaCl處理）凝膠上蛋白質(zhì)有（935±27）個(gè)，兩個(gè)試驗(yàn)組內(nèi)變異系數(shù)都在5%以內(nèi)。軟件匹配和手工匹配相結(jié)合，最終處理組和對(duì)照組間有725個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)成功匹配。選取相對(duì)豐度（vol%）發(fā)生1.5倍改變的點(diǎn)為差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，結(jié)合 MALDI-TOF-TOF/MS 分析，Mascot 軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫Green Plants， 最終成功鑒定出21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，為19種不同的蛋白質(zhì)（表1）。

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類

基于質(zhì)譜結(jié)果， 將這些蛋白的功能分為以下五大類。

Ⅰ類：脅迫防御類蛋白，共有4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，spot 3）、2個(gè)抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，spot 8，18）、病原相關(guān)蛋白2（Pathogenesis-related protein 2，spot 12）。

Ⅱ類：碳水化合物和能量代謝，共4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。線粒體蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase mitochondrial，spot 6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases，spot 14）、線粒體ATP合酶β支鏈2（ATP synthase bate china 2 mitochondrial，spot 1）、核苷二磷酸激酶1（Nucleoside diphosphate kinase 1，spot 21）。

Ⅲ類：次級(jí)代謝，共5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。異甘草黃苷2′-甲基轉(zhuǎn)移酶（Isoliquiritigenin 2′-O-methyltransferase，spot 7）、查爾酮還原酶（Chalcone reductase， spot 13）、3-異丙基蘋果酸脫氫酶（3-Isopropylmalate dehydrogenase，spot 16）、異黃酮還原酶（Isoflavone reductase，spot 11）；乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，spot 17）。

Ⅳ類：轉(zhuǎn)錄、翻譯和調(diào)節(jié)類蛋白，共4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A-2（Eukaryotic translation initiation factor 5A-2，spot 4）、熱激蛋白70 （Heat shock protein 70，spot 5）、RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein，spot 9）、mRNA結(jié)合蛋白前體（mRNA binding protein precursor，spot10）。

Ⅴ類：信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，共3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42（Vacuole-associated annexin VCaB42，spot 15）、膜聯(lián)蛋白（Annexin，spot 19）、細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP酶（Plasma membrane H+-ATPase，spot 2）。

3 討論

3.1 脅迫防御類蛋白

生物正常的生理代謝過程，如光合成、光呼吸、脂肪酸氧化和衰老等都會(huì)產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），但當(dāng)生物和非生物產(chǎn)生脅迫時(shí)，將引發(fā)ROS的迸發(fā)。ROS具有多種功能，一方面，低水平的ROS可作為信號(hào)傳導(dǎo)分子，調(diào)控植物生長發(fā)育、細(xì)胞周期以及細(xì)胞程序化死亡、激素合成、生物或非生物的脅迫應(yīng)答等；另一方面，過量ROS可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂和其他細(xì)胞組分的損傷，對(duì)植物的生長產(chǎn)生危害[9]。植物體內(nèi)有多種ROS清除機(jī)制，以維持體內(nèi)正常的ROS水平。在本研究中，3個(gè)過氧化物類酶表達(dá)量上調(diào)，其中包括2個(gè)抗壞血酸過氧化物酶（APX，8、18號(hào)）和1個(gè)谷胱甘肽過氧化物酶（GPX，3號(hào)）。APX和GPX分別以抗壞血酸和谷胱甘肽作為底物，與H2O2的親合力較強(qiáng)，是植物體H2O2重要的清除劑。APX催化H2O2還原反應(yīng)中產(chǎn)生的單脫氫抗壞血酸，通過谷胱甘肽還原酶途徑被還原為抗壞血酸，而還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生，產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原，形成抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（Ascorbate-glutathione cycle），是植物清除H2O2的最主要途徑。有研究認(rèn)為，活性氧清除機(jī)制是植物抗鹽堿機(jī)制的重要組成部分[10]。在本研究中活性氧清除蛋白質(zhì)在鹽脅迫下表達(dá)量均上升，這有利于清除鹽脅迫引起的活性氧迸發(fā)，維持苜蓿細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)了病原相關(guān)蛋白2（Pathogenesis-related protein 2，PR2）在鹽脅迫下表達(dá)量上升。病原相關(guān)蛋白是一類由真菌、細(xì)菌和病毒等病原體入侵誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗逆性蛋白質(zhì)，根據(jù)作用和功能的不同將其分為17個(gè)家族，本研究中鑒定的差異表達(dá)蛋白PR2屬于β-1，3-葡聚糖酶家族，其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的細(xì)胞壁，參與植物生長發(fā)育的各個(gè)階段的調(diào)控[11]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下PR5蛋白質(zhì)表達(dá)量下降，而在抗鹽堿能力相對(duì)較強(qiáng)的鹽芥（Thellungiella halophila）中，鹽脅迫下PR5蛋白質(zhì)表達(dá)量下降[12]，這表明部分PR蛋白質(zhì)也參與到鹽脅迫調(diào)節(jié)。在此前的研究中還未發(fā)現(xiàn)PR2與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)，其功能還有待深入研究。

3.2 參與碳水化合物和能量代謝的相關(guān)蛋白

植物生長發(fā)育過程中需要大量的能量以維持體內(nèi)正常的生理代謝，這些能量主要通過碳水化合物代謝，如糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP）和三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）產(chǎn)生。在本研究中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，14號(hào)）在鹽脅迫下表達(dá)量上升。GAPDH是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，催化甘油醛-3-磷酸形成1，3-二磷酸甘油酸的可逆反應(yīng)，是糖酵解（糖異生）中惟一的氧化（還原）反應(yīng)。此前對(duì)水稻的研究表明，抗鹽堿性水稻的材料中GAPDH蛋白表達(dá)量顯著高于敏鹽性材料，表明GAPDH的高表達(dá)可能與水稻抗鹽堿相關(guān)[13]。另有研究表明，非磷酸化GAPDH（NP-GAPDH）可催化糖酵解“旁路”反應(yīng)，催化依賴于NADP+，將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸，同時(shí)伴有NADPH生成的不可逆反應(yīng)[14]。鹽脅迫下，GAPDH的表達(dá)量上升一方面可為機(jī)體合成代謝提供還原力NADPH，維持胞質(zhì)中NADPH的水平，另一方面在磷饑餓或ADP水平低下而無法合成ATP時(shí)，可以使碳源順利流經(jīng)糖酵解途徑，保證逆境條件下碳源流的通暢[15]。本研究中，GAPDH在鹽脅迫下表達(dá)量上升可能是苜蓿適應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

線粒體是植物生成能量的主要細(xì)胞器，在本研究中鑒定出2個(gè)線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變。線粒體蘋果酸脫氫酶屬于NAD-依賴性MDH，其為三羧酸循環(huán)循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換，生產(chǎn)ATP，為機(jī)體提供能量[16]。線粒體ATP合成酶參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下合成ATP，將能量用于合成生物中的能量通貨-ATP的能量轉(zhuǎn)換。這2個(gè)蛋白表達(dá)量的下降從一個(gè)側(cè)面表明了鹽脅迫下，紫花苜蓿能量代謝減緩，這與鹽脅迫下光合作用受阻而導(dǎo)致碳水化學(xué)物合成減少相關(guān)。此外研究還鑒定出1個(gè)核苷二磷酸激酶1（NDPK1）在鹽脅迫下表達(dá)量降低。NDPK被稱為ATP的管家酶，維持細(xì)胞中CTP、GTP、UTP的水平。在植物中NDPK已被證明參與干旱、寒害、熱和鹽脅迫的抗逆中，在水稻小穗期響應(yīng)鹽脅迫的蛋白質(zhì)研究中鑒定出該蛋白表達(dá)量下調(diào)[17]。

3.3 次生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

植物在多條代謝途徑中都會(huì)產(chǎn)生乙醇，但當(dāng)特定外界脅迫時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)乙醇積累，過量乙醇聚合成高活性的有毒分子，攻擊細(xì)胞內(nèi)親核物質(zhì)如核酸、蛋白和碳水化合物等，最終危害到植物的正常生長[18]。乙醇脫氫酶（ADH，17號(hào)）是植物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，生理學(xué)功能為催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)。有研究表明，ADH的表達(dá)與干旱、低溫、病原菌入侵等生物逆境的應(yīng)答相關(guān)[19]。在本研究中，ADH在鹽脅迫下表達(dá)量下降，這與此前在水稻中的研究觀察到的結(jié)果相反[20]，這可能與脅迫濃度和植物自身的抗鹽堿差異性相關(guān)。

類黃酮化合物是植物合成的一類重要次生代謝產(chǎn)物，目前已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的有6 000多種，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[21]。近期研究表明，類黃酮化合物還參與植物的脅迫防御中，如植物受微生物侵染時(shí)其作為植保素在植物體內(nèi)積累，或作為植物體內(nèi)活性氧的脫毒系統(tǒng)[22，23]。在鑒定的差異表達(dá)蛋白中有2個(gè)蛋白質(zhì)與類黃酮代謝途徑相關(guān)，其中包括查爾酮還原酶（13號(hào)）和查爾酮還原酶（11號(hào)）。查爾酮還原酶是查爾酮合成類黃酮代謝分支的第一步催化酶。查爾酮還原酶是合成植物抗毒素類異黃酮的重要酶。本研究中，這2個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量都呈現(xiàn)出下降的趨勢，這表明鹽脅迫下，類黃酮合成代謝減緩。

在鑒定的蛋白質(zhì)中，3-異丙基蘋果酸脫氫酶（16號(hào)）表達(dá)量下升，該蛋白質(zhì)為異亮氨酸合成蛋氨酸過程中的催化蛋白酶。已有研究表明，異亮氨酸也是苜蓿抗?jié)B透脅迫的因子[24]。本研究中該蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，有利于異亮氨酸的積累，可能是紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)機(jī)制之一。

3.4 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蛋白質(zhì)合成和代謝類的蛋白質(zhì)

植物感受到外界環(huán)境刺激，通過特定的受體將這一信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，并誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)外界環(huán)境，在這過程中，受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄、翻譯和剪切修飾等調(diào)控。在鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，有3個(gè)蛋白質(zhì)參與到轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中包括1個(gè)真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A-2（eIF-5A-2，4號(hào)）和2個(gè)RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。eIF-5A是普遍存在于真核生物和原始細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄啟始因子。已有研究表明，eIF-5A與細(xì)胞中的許多生命活動(dòng)有關(guān)，如細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)翻譯、mRNA降解、細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化及細(xì)胞衰老與凋亡等[25]。對(duì)擬南芥eIF-5A家族成員的分析表明，不同的家族成員參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與植物不同的生理防御相關(guān)，其中eIF-5A-2參與擬南芥受到病毒感染和傷害后的信號(hào)傳導(dǎo)，以及通過細(xì)胞分裂素信號(hào)通路調(diào)控?cái)M南芥根木質(zhì)部的發(fā)育，在細(xì)胞的分裂、生長和死亡中發(fā)揮著重要作用[24]。在本研究中，eIF-5A-2在鹽脅迫下表達(dá)量上升，表明其表達(dá)與鹽誘導(dǎo)相關(guān)。

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中每一步都需要大量的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA相互作用來起穩(wěn)定、保護(hù)、組裝和轉(zhuǎn)移等作用。近年來的研究表明，一些RNA結(jié)合蛋白質(zhì)參與動(dòng)植物各種脅迫調(diào)控并發(fā)揮著重要生理功能，如富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)控植物逆境誘導(dǎo)反應(yīng)，許多逆境因子，包括冷害、致傷、干旱、過敏和水逆境等均能誘導(dǎo)其表達(dá)量發(fā)生變化[26]。在本研究中mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)（10號(hào)）在鹽脅迫下表達(dá)量下降，而RNA結(jié)合蛋白質(zhì)（9號(hào)）表達(dá)量則上升，表明鹽脅迫下紫花苜蓿在轉(zhuǎn)錄水平存在差異性調(diào)節(jié)機(jī)制。

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊增加，重新建立正常的蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)尤為重要。熱激蛋白70（Hsp70）是重要的分子伴侶，在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象、阻止蛋白質(zhì)聚合、重折疊變性蛋白質(zhì)以及協(xié)助錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解等方面發(fā)揮著重要作用[27，28]。在本研究中，Hsp70（5號(hào)）在鹽脅迫下表達(dá)量上升，這對(duì)維持體內(nèi)蛋白質(zhì)正常的生理功能有重要意義。

3.5 信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白

Ca2+是植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子，在受到多種脅迫時(shí)都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)中Δ[Ca2+]cyt，特定的膜聯(lián)蛋白質(zhì)（Annexins）通過結(jié)合Δ[Ca2+]cyt而進(jìn)行信息傳遞[29]。Annexins是一個(gè)多基因蛋白質(zhì)，屬于Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)家族成員，通過與磷脂的結(jié)合以及與鈣離子的相互作用參與到各種膜有關(guān)的過程，其中包括信號(hào)傳導(dǎo)、自由基清除、DNA復(fù)制和細(xì)胞凋亡等過程。目前，最少有3條線支持這一結(jié)論的證據(jù)：各種生物脅迫都會(huì)誘導(dǎo)Annexins表達(dá)量發(fā)生改變；改變某些Annexins的表達(dá)量將改變植物對(duì)非生物脅迫的耐受性；Annexins可能直接參與調(diào)節(jié)脅迫激活信號(hào)通路[30]。在本研究中，鑒定出2個(gè)膜聯(lián)蛋白質(zhì)表達(dá)量上升，分別為膜聯(lián)蛋白質(zhì)和液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42，這表明鹽脅迫下紫花苜蓿信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生改變。

將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡，減少細(xì)胞質(zhì)中Na+離子濃度是植物抗鹽脅迫的重要機(jī)制之一。在本研究中細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP酶（15號(hào)）表達(dá)量上升。質(zhì)膜H+-ATPase主要作用是形成跨膜的質(zhì)子梯度，驅(qū)動(dòng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)主動(dòng)運(yùn)輸，進(jìn)而將Na+區(qū)隔在液泡中，減少對(duì)細(xì)胞器的毒害[31]。鹽脅迫下，該蛋白質(zhì)表達(dá)量上升有助于降低細(xì)胞基質(zhì)中鹽離子的濃度，從而減小鹽離子對(duì)植物的危害。

4 結(jié)論

根是植物感受多種脅迫傷害的最初位點(diǎn)，根對(duì)脅迫的敏感程度直接關(guān)系到植物的生長，對(duì)根系響應(yīng)鹽脅迫的研究有助于更深入了解鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。在本研究中，鑒定出19個(gè)不同的蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變，其中包括14個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì)，5個(gè)表達(dá)下降蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中大部分蛋白質(zhì)都是功能已知的蛋白質(zhì)，此前在其他物種抗鹽堿脅迫中也鑒定出，部分蛋白質(zhì)在此前研究中未見報(bào)道，其具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為深入揭示紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為挖掘紫花苜蓿潛在抗鹽堿基因提供了數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] FAO.The state of the worlds land and water resources for food and agriculture （SOLAW）-Managing systems at risk [EB/OL].London：The Food and Agriculture Organization of the United Nations and Earthscan. http：//www.fao.org/docrep/015/i1688e/i1688e00.pdf，2011.

[2] VINOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress： Achievements and limitations[J]. Current Opinion in Biotechnology，2005，16（2）：123-132.

[3] MAAS E， HOFFMAN G. Crop salt tolerance： Evaluation of existing data[A]. In： Managing Saline Water for Irrigation Proceedings of the International Salinity Conference Ed HE Dregne[C]： 1977. 187-198.

[4] LIMAMI A M， RICOULT C， PLANCHET E， et al. Response of Medicago truncatula to abiotic stress[EB/OL].http：//www noble org/MedicagoHandbook，2007-06-15.

[5] POSTNIKOVA OA， SHAO J， NEMCHINOVL G. Analysis of the alfalfa root transcriptome in response to salinity stress[J]. Plant & cell physiology， 2013， 54（7）：1041-1055.

[6] JIN H， SUN Y， YANG Q， et al. Screening of genes induced by salt stress from Alfalfa[J]. Molecular Biology Reports，2010， 37（2）：745-753.

[7] ZHANG H， HAN B， WANG T， et al. Mechanisms of plant salt response： insights from proteomics[J]. J Proteome Res，2012， 11（1）：49-67.

[8] XIONG J， YANG Q， KANG J， et al. Simultaneous isolation of DNA， RNA， and protein from Medicago truncatula L[J]. Electrophoresis，2011，32（2）：321-330.

[9] LALOI C， APEL K， DANON A. Reactive oxygen signalling： The latest news[J]. Current Opinion in Plant Biology，2004， 7（3）：323-328.

[10] ABOGADALLAH G M. Antioxidative defense under salt stress[J]. Plant Signal Behav， 2010， 5（4）：369-374.

[11] BORAD V， SRIRAM S. Pathogenesis-related proteins for the plant protection[J]. Asian J Exp Sci， 2008， 22（3）：189-169.

[12] PANG Q， CHEN S， DAI S， et al. Comparative proteomics of salt tolerance in Arabidopsis thaliana and Thellungiella halophila[J].Journal of Proteome Research，2010， 9（5）：2584-2599.

[13] LIU C W， CHANG T S， HSU Y K， et al. Comparative proteomic analysis of early salt stress-responsive proteins in roots and leaves of rice[J]. Proteomics， 2014， 14（15）：1759-1775.

[14] 盧 倩，弭曉菊，崔繼哲.植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013，12（8）：1-6.

[15] RIUS S P， CASATI P， IGLESIAS A A， et al. Characterization of Arabidopsis lines deficient in GAPC-1， a cytosolic NAD-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[J]. Plant Physiology， 2008， 148（3）：1655-1667.

[16] 汪新穎，王 波，侯松濤，等.蘋果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能[J].生物學(xué)雜志，2009，26（4）：69-72.

[17] TANG L， KIM M D， YANG K S， et al. Enhanced tolerance of transgenic potato plants overexpressing nucleoside diphosphate kinase 2 against multiple environmental stresses[J]. Transgenic Research， 2008， 17（4）：705-715.

[18] SCHAUENSTEIN E， ESTERBAUER H， ZOLLNER H. Aldehydes in biological systems[M]. London： Pion， 1977.

[19] 石之光，葉 磊，鞏鵬濤，等.乙醇脫氫酶（ADH）家族生物信息學(xué)分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（3）：429-432.

[20] SENGUPTA S，MAJUMDER A L.Insight into the salt tolerance factors of a wild halophytic rice，Porteresia coarctata：A physiological and proteomic approach[J].Planta，2009，229（4）：911-929.

[21] 鄒鳳蓮，壽森炎，葉紈芝，等.類黃酮化合物在植物脅迫反應(yīng)中作用的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞生物學(xué)，2004，26（1）：39-44.

[22] LIN C M，CHEN C T，LEE H H，et al. Prevention of cellular ROS damage by isovitexin and related flavonoids[J]. Planta Medica，2002，68（4）：365-367.

[23] PICMAN A K，SCHNEIDER E F，PICMAN J.Effect of flavonoids on mycelial growth of Verticillium albo-atrum[J]. Biochemical Systematics and Ecology，1995，23（7）：683-693.

[24] FENG H， CHEN Q， FENG J， et al. Functional characterization of the Arabidopsis eukaryotic translation initiation factor 5A-2 that plays a crucial role in plant growth and development by regulating cell division， cell growth， and cell death[J]. Plant Physiology， 2007， 144（3）：1531-1545.

[25] 時(shí)廣紅，王彥珍，魏建華.eIF-5A與DHS功能研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009，21（5）：21-26.

[26] 陳 璇，李文正，邵 巖，等.動(dòng)植物中 RNA 結(jié)合蛋白的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007，25（3）：9-15.

[27] WANG W，VINOCUR B，SHOSEYOV O，et al. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science 2004，9（5）：244-252.

[28] HARTL F U.Molecular chaperones in cellular protein folding[J]. Nature，1996，381（6583）：571-579.

[29] MORTIMER J C，LAOHAVISIT A，MACPHERSON N，et al. Annexins：Multifunctional components of growth and adaptation[J].Journal of Experimental Botany，2008，59（3）：533-544.

[30] KONOPKA-POSTUPOLSKA D，CLARK G，GOCH G，et al.The role of annexin 1 in drought stress in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2009，150（3）：1394-1410.

[31] SHI H，QUINTERO F J，PARDO J M，et al.The putative plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 controls long-distance Na+ transport in plants[J].The Plant Cell Online，2002，14（2）：465-477.