柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定16種氨基酸

趙紅玲，高 楊，王小青，王良友，尹志峰（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

技術(shù)方法

柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定16種氨基酸

趙紅玲，高 楊，王小青，王良友，尹志峰
（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

柱前衍生；異硫氰酸苯酯；氨基酸；高效液相色譜法

氨基酸是自然界中一種重要的生命物質(zhì)，作為蛋白質(zhì)的基本組成單元，在動(dòng)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和多肽的合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。有研究表明，某些氨基酸對(duì)動(dòng)物體內(nèi)多種生命活動(dòng)起到調(diào)節(jié)作用，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝、調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1-2］。因此，氨基酸的分離、分析方法及應(yīng)用逐漸引起人們的關(guān)注［3］。

近年來(lái)，隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，衍生色譜法開(kāi)始應(yīng)用于氨基酸的測(cè)定［4］。目前，應(yīng)用較多的是柱前衍生-反相高效液相色譜法（RP-HPLC），該方法的原理是在特定條件下某衍生化試劑在色譜柱前與氨基酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有利于色譜分離或檢測(cè)的氨基酸衍生物［5］。

本研究以異硫氰酸苯酯（PITC）為柱前衍生化試劑，采用RP-HPLC法對(duì)16種氨基酸進(jìn)行分析測(cè)定，為蛋白質(zhì)或多肽類藥物的氨基酸組成分析提供有效可行的測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC98-I AAA氨基酸分析儀、二元梯度泵、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、紫外檢測(cè)器（北京溫分分析儀器技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；浙大智達(dá)N2000色譜數(shù)據(jù)工作站；純水器（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：140624-200805）：包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）。

1.3 其它試劑 甲醇、乙腈（色譜純?cè)噭?，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；分析純?cè)噭┌ǎ寒惲蚯杷岜锦ィ≒ITC，阿拉丁試劑），冰醋酸、正己烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三乙胺（北京興福精細(xì)化學(xué)研究所），無(wú)水醋酸鈉（天津市博迪化工股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精確稱取16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各10μ mol，用0.1mol/L的鹽酸溶液定容至10ml，配制溶度為1μ mol/ml的氨基酸混合對(duì)照品溶液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 柱前衍生化 精密量取氨基酸混合對(duì)照品溶液200μl，分別加入0.1mol/L的PITC乙腈溶液（0.12ml PITC用乙腈定容至10ml，搖勻）和1mol/L的三乙胺乙腈溶液（1.35ml三乙胺用乙腈定容至10ml，搖勻）各100μl，搖勻后室溫靜置1h，加入正己烷400μl，充分振搖，靜置10min，吸取下層溶液100μl，用超純水稀釋5倍，過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液10μl進(jìn)樣。

2.3 色譜分析條件 流動(dòng)相A：無(wú)水醋酸鈉8.2g用1000ml超純水溶解，配制成0.1mol/L的醋酸鈉溶液，用醋酸調(diào)至pH=6.5；流動(dòng)相B：乙腈。色譜柱：Kromasil C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）；柱溫：40℃；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。梯度洗脫程序見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)16種氨基酸混合對(duì)照品溶液，用0.1mol/L的鹽酸溶液依次稀釋為0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125μmol/ml，按“2.2”項(xiàng)的方法衍生化后分別進(jìn)樣分析。以氨基酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2：

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)氨基酸混合對(duì)照品溶液200μl，經(jīng)衍生化后連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各氨基酸的峰面積積分值。結(jié)果，16種氨基酸的峰面積對(duì)應(yīng)的RSD均＜1.9%，表明儀器精密度良好。

3 討論

分別考察Innoval C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），Accurasil C18色譜柱（4.6×250mm， 5μm），Venusil C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），Kromasil C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）對(duì)16種氨基酸的分離效果，結(jié)果Kromasil C18色譜柱的分離效果最佳。醋酸鈉緩沖液的鹽濃度會(huì)影響氨基酸的分離效果，研究發(fā)現(xiàn)，以0.1mol/L的醋酸鈉溶液作為水相時(shí)，各個(gè)氨基酸得到了較好的分離。

衍生化試劑PITC對(duì)色譜柱有一定的損害，用正己烷萃取后可有效減少PITC的殘留，同時(shí)在色譜柱前加保護(hù)柱，可以減少對(duì)色譜柱的損害，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

本研究采用的柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定氨基酸的方法具有準(zhǔn)確、可靠、精密度高等特點(diǎn)，為進(jìn)一步應(yīng)用于蛋白質(zhì)或多肽類藥物的氨基酸組成分析提供了依據(jù)。

［1］葉元土，王永玲，蔡春芳，等.谷氨酰胺對(duì)草魚(yú)腸道L-亮氨酸、L-脯氨酸吸收及腸道蛋白質(zhì)合成的影響［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，20（1）：28-32.

［2］Matte JJ，Lefloc HN，Primot Y，et al.Interaction between dietary tryptophan and pyridoxine on tryptophan metabolism，immune responses and growth performance in post-weaning pigs［J］. Animal Feed Science and Technology，2011，170（3）：256-264.

［3］Bhushan R， Bruckner H. Marfey's reagent for chiral amino acid analysis： A review［J］. Amino Acids，2004，27（3-4）：231-247.

［4］Roach MC，Harmony MD.Determination of amino acids at subfemtomole levels by high- performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection［J］. Anal Chem，1987，59（3）： 411-415.

［5］章麗，劉松雁.氨基酸測(cè)定方法的研究進(jìn)展［J］.河北化工，2009，32（5）：27-29.

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1004-6879（2015）01-0051-03

2014-09-26）