重慶地區(qū)辣椒疫霉菌的分離培養(yǎng)及生理小種鑒定

張世才, 熊 艷, 黃任中, 李怡斐, 呂中華, 黃啟中

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 重慶 401329)

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重慶地區(qū)辣椒疫霉菌的分離培養(yǎng)及生理小種鑒定

張世才, 熊 艷, 黃任中, 李怡斐, 呂中華, 黃啟中*

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 重慶 401329)

本試驗(yàn)分離鑒定了來源于重慶不同辣椒產(chǎn)區(qū)的14個(gè)病原菌分離物, 經(jīng)形態(tài)特征鑒定及回接發(fā)病特征觀察,確定這些菌株均為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。14個(gè)菌株在OMA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的孢子囊形態(tài)類似,形狀多為卵圓形或長橢圓形,乳突明顯。對PDA、OMA、CA及V8汁4種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀觀察表明,辣椒疫霉菌株在OMA培養(yǎng)基上生長速度最快,但在V8汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多。采用灌根法對14個(gè)菌株進(jìn)行生理小種鑒別,其中10個(gè)為race 3,2個(gè)為race 2,2個(gè)為race 1,初步推定race 3為重慶地區(qū)辣椒疫病病原菌的優(yōu)勢小種。

重慶; 辣椒疫霉; 培養(yǎng)性狀; 生理小種

由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)侵染引起的辣椒疫病是辣椒生產(chǎn)上的重要病害[1]。迄今,在我國廣東、陜西和四川等多個(gè)地區(qū)辣椒種植區(qū)均有辣椒疫病大面積發(fā)生的報(bào)道,重慶作為我國辣椒主產(chǎn)區(qū)之一,近年來隨著種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及常年連作種植,該病害逐年加重,嚴(yán)重制約著辣椒生產(chǎn)。研究表明,不同辣椒疫霉菌菌株不但致病力存在顯著差異,還存在生理小種分化的情況,且不同地區(qū)優(yōu)勢生理小種也可能存在差異[2-4]。為了明確重慶地區(qū)辣椒疫霉菌生理小種構(gòu)成及其分布,本研究對采自11個(gè)辣椒產(chǎn)區(qū)的14個(gè)分離物在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀進(jìn)行觀察,并通過接種鑒別寄主明確了這14個(gè)分離物的生理小種類型,以期對辣椒疫病的防治及抗病品種的分布與選育提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒病樣于2011-2013年采自重慶潼南、銅梁、永川、江津、合川、北碚、巴南、石柱等辣椒主產(chǎn)區(qū)。經(jīng)分離、純化獲得14株辣椒疫霉菌菌株,菌株來源及編號見表1。

表1 病原菌的采集地點(diǎn)、辣椒品種及采樣組織

1.2 病原菌分離與保存

疫霉菌分離參照鄭小波[5]的方法,從重慶辣椒主產(chǎn)區(qū)發(fā)病田塊采集具有辣椒疫病典型癥狀的病莖或病果,用自來水將組織表面沖洗干凈,然后切取病健交界處組織2～3小塊,置于選擇性燕麥培養(yǎng)基(OMA)平板上(含青霉素50 mg /L、五氯硝基苯50 mg/L、利福平100 mg/L),25～28 ℃培養(yǎng)2 d后,挑取菌落邊緣菌絲少許,轉(zhuǎn)接到不含藥劑的OMA培養(yǎng)基上,在25～28 ℃培養(yǎng)3 d,之后從菌落邊緣挑取菌絲少許,在OMA培養(yǎng)基上培養(yǎng),進(jìn)行菌株純化。從純化的菌株菌落邊緣切取病原物菌塊,回接到辣椒植株莖部,28 ℃下棉花保濕培養(yǎng),選取表現(xiàn)與田間癥狀相同的分離物進(jìn)行菌株鑒定。純化后的菌株轉(zhuǎn)接入V8汁培養(yǎng)基試管斜面,于28 ℃下培養(yǎng)5～7 d,待菌絲長滿斜面,于16 ℃環(huán)境中保存。

1.3 病原菌鑒定

將純化的菌株接種到OMA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)3 d后,切取菌落邊緣菌絲塊移至OMA平板中央,在28 ℃黑暗恒溫下培養(yǎng)7 d后,觀察病原菌的菌落形態(tài)、菌絲以及孢子囊的形態(tài)特征。

1.4 不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀觀察

選擇疫霉菌分離培養(yǎng)常用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)、V8汁培養(yǎng)基及燕麥培養(yǎng)基(OMA)4種,測定不同培養(yǎng)基對菌株菌落生長速度及產(chǎn)孢的影響。選取TNB為供試菌株,TNB在上述4種培養(yǎng)基上生長3 d后,用打孔器(內(nèi)徑4 mm)沿菌落邊緣打取菌絲塊,移至4種培養(yǎng)基平板中央,每皿1塊,分別轉(zhuǎn)接3皿,重復(fù)3次。培養(yǎng)皿直徑為9 cm,每皿倒14 mL培養(yǎng)基。接種后將培養(yǎng)皿置于28 ℃黑暗培養(yǎng)。5 d后觀察供試菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲密度,并測量菌落直徑。供試菌株繼續(xù)黑暗培養(yǎng)14 d后,顯微鏡觀察孢子囊數(shù)量。

1.5 生理小種的測定

1.5.1 鑒別寄主

鑒別寄主由世界蔬菜研究中心提供,分別為‘Early calwonder’、‘PBC137’、‘PBC602’和‘PI201234’。其中‘Early calwonder’不帶抗病基因,其他3個(gè)分別含有不同的抗病基因(表2),其組合可用于鑒別辣椒疫霉生理小種race 1、race 2及race 3。

表2 辣椒疫霉生理小種的判定1)

1) S為感?。籖為抗病。

S means susceptible; R means resistant.

1.5.2 病原菌的培養(yǎng)

病原菌的培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[6],略有改動。將分離保存的14個(gè)待測菌株分別在V8汁培養(yǎng)基上于28 ℃下培養(yǎng)7 d,再將其置于熒光燈下照射48 h以誘發(fā)其產(chǎn)生孢子囊。待產(chǎn)生大量孢子囊后加入適量無菌水,用刀片刮動平板培養(yǎng)基表面收集菌絲和孢子囊。收集的病原菌培養(yǎng)物用兩層紗布過濾后將孢子懸浮液置于4 ℃下30 min,然后置于室溫下3 h以促進(jìn)游動孢子的形成和釋放。

1.5.3 鑒別寄主的培育

鑒別寄主的種子首先用10%的次氯酸鈉溶液浸泡5～10 min,然后用清水沖洗干凈,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待種子發(fā)芽后播于裝有育苗基質(zhì)的60孔育苗穴盤內(nèi)。育苗基質(zhì)成分為草炭和蛭石(2∶1)?；|(zhì)經(jīng)高溫蒸汽滅菌(121 ℃,30 min)。待出苗后,幼苗置于25 ℃日光溫室內(nèi)培養(yǎng),常規(guī)肥水管理。

1.5.4 接種

當(dāng)鑒別寄主幼苗長至6～7葉時(shí)進(jìn)行孢子懸浮液灌根接種,每個(gè)待測菌株分別接種1套鑒別寄主,3次重復(fù),每個(gè)鑒別寄主接種30株,接種游動孢子濃度1×103個(gè)/mL。接種前澆透水,用移液器吸取3 mL孢子懸浮液注入鑒別寄主根部附近基質(zhì),接種后將植株置于25 ℃溫室內(nèi),每天光照10～12 h,接種后適時(shí)澆水,使基質(zhì)濕度保持近飽和狀態(tài)。

1.5.5 病害調(diào)查及小種鑒定

接種7 d后調(diào)查幼苗莖基部發(fā)病情況,確定待測菌株的生理小種類型。鑒別寄主的感抗類型：發(fā)病率>20%為感病型,發(fā)病率≤20%為抗病型[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病害調(diào)查

對重慶地區(qū)辣椒疫病的田間調(diào)查結(jié)果表明,辣椒疫病在各區(qū)縣均有發(fā)生,且在不同地區(qū),不同品種上病情存在差異。病害發(fā)生期主要為5-7月,適宜溫度25～30 ℃,植株受侵染后,病部呈水漬狀,后迅速變褐,病部明顯縊縮,造成地上部折倒。果實(shí)染病始于蒂部,初生暗綠色水漬狀斑,隨后變褐軟腐,濕度較大時(shí)表面長出白色霉層,即為病原菌孢囊梗及孢子囊(圖1)。

圖1 辣椒疫霉侵染植株的典型癥狀Fig.1 The typical symptoms of pepper infected by P.capsici

2.2 辣椒疫霉形態(tài)特征

以田間采集的辣椒樣品為材料,共分離純化得到14個(gè)菌株,這14個(gè)菌株在OMA上生長速度較快,氣生菌絲中等、菌絲無隔膜,孢囊梗分枝不規(guī)則,

成熟的孢子囊具長柄,易脫落。孢子囊形狀以橢圓形和長橢圓形為主,乳突明顯,孢子囊在水中能釋放出游動孢子,游動孢子腎形,帶有鞭毛(圖2),初步確定其均為辣椒疫霉。

圖2 辣椒疫霉孢子囊的產(chǎn)生及游動孢子的釋放Fig.2 Sporangia and zoospores of P.capsici

2.3 辣椒疫霉在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

本試驗(yàn)所分離的菌株TNB在4種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性(表3、圖3)明顯不同。在OMA平板上的菌落呈絨毛狀,氣生菌絲很多,菌絲較疏松、色白、生長很快;在CA和PDA上的菌落為棉絮狀,氣生菌絲較多,菌絲濃密、較厚、生長較慢;而在V8汁平板上呈放射狀生長,菌落扁平、菌絲較薄,色較淺,菌絲生長速度較快。產(chǎn)孢方面則表現(xiàn)為在V8汁培養(yǎng)基上孢子囊數(shù)量最多,OMA次之?？梢?菌株的菌落形態(tài)、生長速度及菌絲疏密程度與孢子囊數(shù)量之間沒有明顯的相關(guān)性。

表3 辣椒疫霉在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀1)

1) “+”表示孢子囊數(shù)量較少;“++”表示孢子囊數(shù)量中等;“+++”表示孢子囊數(shù)量較多；“++++”表示孢子囊數(shù)量很多。數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示生長速率間在0.05水平差異顯著。

“+”means a small number of sporangium； “++” means a moderate number of sporangium； “+++” means a larger number of sporangium； “++++” means the largest number of sporangium. Data with different small letters are significantly different at 0.05 level.

圖3 辣椒疫霉在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Fig.3 The culture characters of P.capsici isolates on different media

2.4 辣椒疫霉生理小種鑒定

按照世界蔬菜研究中心提供的鑒別寄主,采用李智軍[4]的方法對重慶地區(qū)14個(gè)辣椒疫霉菌菌株進(jìn)行了生理小種鑒定,結(jié)果表明,BB和SZ菌株屬于race 1,TNZ、TNB菌株屬于race 2,而DX、YD、YC、JJ、RC、HC、TL、TNY、TNG及HT菌株屬于race 3(表4)。race 3所占比例最大,為71%。

表4 不同地區(qū)的辣椒疫霉菌生理小種確定1)

1) 括號內(nèi)數(shù)據(jù)為接種后第7天的發(fā)病率(%)。S：感病;R：抗病。

Data in the parenthesis are disease incidence (%) at 7th day after inoculation. S means susceptible；R means resistant.

3 討論

本研究對來源于重慶11個(gè)辣椒產(chǎn)區(qū)的14個(gè)辣椒疫霉分離物進(jìn)行了鑒定,經(jīng)菌絲及孢子囊形態(tài)特征觀察,參照鄭小波等[5]對辣椒疫霉菌的描述,確定這14個(gè)菌株均為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。

關(guān)于辣椒疫霉菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、孢子囊的產(chǎn)生等生物學(xué)性狀前人已有報(bào)道,徐作珽等[7]發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉在玉米面和燕麥片培養(yǎng)基上生長最佳;戚仁德等[8]認(rèn)為辣椒疫霉菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀存在差異,HX-1菌株在OMA培養(yǎng)基上生長最快,產(chǎn)生孢子囊數(shù)量最多,比較適合生長。本研究結(jié)果表明辣椒疫霉菌同一菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀存在明顯差異,具體表現(xiàn)為TNB菌株在OMA培養(yǎng)基上生長最快,但在V8汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多,菌株的菌落形態(tài)、生長速度與孢子囊數(shù)量無關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)采自不同地區(qū)的辣椒疫霉菌株在同一培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀也有所不同,這與前人的研究結(jié)果相吻合。

本研究利用一套鑒別寄主,采用灌根法對重慶地區(qū)14株辣椒疫霉菌進(jìn)行了生理小種鑒定,發(fā)現(xiàn)有10株屬于race 3,2株屬于race 1,2株屬于race 2,由此推測race 3為重慶地區(qū)的優(yōu)勢小種。李智軍等[4]的研究結(jié)果表明,race 3為廣東地區(qū)優(yōu)勢生理小種,羅德旭等[9]研究表明,安徽淮安地區(qū)分離得到的3份辣椒疫霉菌均屬于race 1,而馬輝剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)危害江西辣椒的疫霉病原菌生理小種以race 2占優(yōu)勢,由此可見辣椒疫霉生理小種在我國的分布存在差異,對辣椒疫霉優(yōu)勢生理小種在全國的具體分布情況,還需擴(kuò)大采樣范圍進(jìn)一步確認(rèn)。此外,不同的地區(qū)其主栽品種存在差異,因此在選育適合重慶地區(qū)的辣椒抗疫病品種時(shí),應(yīng)采用race 3進(jìn)行抗病性鑒定和抗源篩選,才能獲得有效的抗病性材料或品種。

[1] 楊學(xué)輝,肖崇剛,袁潔.貴州辣椒疫病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,26(4):413-416.

[2] 李萍,江濤,高智謀,等.辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)對辣椒的致病力分化研究[J].植物病理學(xué)報(bào),2012,42(4):431-435.

[3] 羅德旭.辣椒疫霉菌生理小種及其抗性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[4] 李智軍,龍衛(wèi)平,鄭錦榮,等.廣東辣椒疫霉菌分離鑒定及其致病力和生理小種分化研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(1):50-54.

[5] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1997:10-132.

[6] NY/T 2060.1-2011.中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程 第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[7] 徐作珽,李林,魏道君,等.大棚辣椒疫病菌的分離培養(yǎng)及藥劑防治[J].植物保護(hù),1999,25(2):29-31.

[8] 戚仁德,丁建成,顧江濤,等.不同培養(yǎng)基對辣椒疫霉致病力的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2001,29(1):96-97.

[9] 羅德旭,孫玉東,楊紅,等.淮安地區(qū)辣椒疫霉菌生理小種鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,25(1):85-86.

[10]馬輝剛,何烈干,張海良,等.江西省辣椒疫霉生理小種構(gòu)成及其對烯酰嗎啉的敏感性分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2013,40(4):374-378.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Isolation and cultivation ofPhytophthoracapsiciand identification of physiological race in Chongqing

Zhang Shicai, Xiong Yan, Huang Renzhong, Li Yifei, Lü Zhonghua, Huang Qizhong

(Vegetable and Flower Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences,Chongqing 401329, China)

Fourteen isolates collected from different pepper-cultivating regions in Chongqing were determined. Based on their morphological characteristics and symptoms after re-inoculated to pepper, these Isolates were identified asPhytophthoracapsiciLeonian. The sporangia of the fourteen isolates induced on OMA medium were morphologically similar, and most of them were ovate or elliptic, with obvious papillate. There were evident differences in mycelial growth rate, productivity of sporangia on different medium. On the OMA medium, the mycelia grew fastest, while the largest number sporangium are produced on the V8 medium. Physiological race identification test showed that ten isolate belonged to race 3, two isolates belonged to race 1, and two isolate belonged to race 2. Race 3 is probably the dominant race in Chongqing.

Chongqing;Phytophthoracapsici; culture characters; physiological race

2014-03-19

2014-08-06

重慶市科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(cstc2012ggC80005)；重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2011ggBo104);重慶市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(cstc2014jcsf-nycgzhA80026)

S 436.418.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.036

* 通信作者 E-mail: 598261580@qq.com