大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及其在膠質(zhì)瘤治療中的作用

劉 輝，張鵬幸，范菲艷，劉 楠，任東妮，張永生，涂艷陽 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及其在膠質(zhì)瘤治療中的作用

劉 輝，張鵬幸，范菲艷，劉 楠，任東妮，張永生，涂艷陽 （第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西西安710038）

目的：建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、培養(yǎng)、純化方法，并對其進行形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面分子標(biāo)記鑒定，確定其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性和慢病毒對其的可感染性，為其作為載體攜帶目的基因或藥物對膠質(zhì)瘤進行治療提供實驗依據(jù)．方法：通過全骨髓培養(yǎng)法、差速貼壁的原理和形態(tài)學(xué)觀察分離、純化出生長旺盛、形態(tài)單一的細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀對分離細(xì)胞進行細(xì)胞表面標(biāo)記分子的鑒定；確定分離細(xì)胞為 BMSCs后將其與膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞共培養(yǎng)觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性，并用慢病毒載體對其進行可感染性的確定．結(jié)果：分離出的 BMSCs以成纖維細(xì)胞樣為主，生長旺盛，呈放射狀排列的細(xì)胞集落，可穩(wěn)定傳代．流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，所分離的細(xì)胞均呈 CD29和 CD90的陽性表達，而CD11b／c和 CD45的表達均呈陰性；按1∶100的比例將 BMSCs和U87MG共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，BMSCs有靶向U87MG的特性并且在一定程度上可以抑制 U87MG的生長；慢病毒可感染我們分離出的BMSCs且感染率較高．結(jié)論：我們采用的方法操作簡單，可在體外分離、鑒定出大量純度高的 BMSCs，并證明了其在體外可以靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，且易于被慢病毒載體感染．這些結(jié)果均為后續(xù)研究 BMSCs提供充足的種子細(xì)胞，將其作為載體攜帶目的基因或藥物治療膠質(zhì)瘤提供了前期的實驗依據(jù)．

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分離；鑒定；趨向性；膠質(zhì)瘤

0 引言

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中克隆性產(chǎn)生的非造血干細(xì)胞，是一類具有多向分化潛能，并且在一定條件下能跨胚層向骨、脂肪和神經(jīng)等多種譜系分化的成體干細(xì)胞［1－2］，其應(yīng)用具有骨髓采集相對安全、方便，供者無明顯并發(fā)癥、可避免倫理學(xué)問題等優(yōu)點，有利于體外擴增和自體回植．因此，BMSCs是理想的種子細(xì)胞來源之一，在基因治療、細(xì)胞替代治療及組織器官再造中具有重要的臨床應(yīng)用價值［3］．惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤，即便最大程度地切除腫瘤后聯(lián)合進行放化療，其預(yù)后仍然很差，其中一個重要的原因就是其在顱內(nèi)呈強侵襲性、轉(zhuǎn)移性生長，其分布的不均勻性導(dǎo)致用重組病毒等載體轉(zhuǎn)染顱內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞成功的轉(zhuǎn)染率不高．而有研究表明，干細(xì)

dentification；tropism；glioma胞載體能克服上述缺點，它具有明顯的趨腫瘤性，在體內(nèi)和體外的實驗中均發(fā)現(xiàn)它能向膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移，并且分布在瘤細(xì)胞周圍［4］．目前，干細(xì)胞聯(lián)合基因治療惡性膠質(zhì)瘤已成為研究膠質(zhì)瘤治療的熱點．?dāng)y帶自殺基因、免疫基因及誘導(dǎo)凋亡基因的干細(xì)胞載體植入膠質(zhì)瘤動物模型體內(nèi)后，既可以很好地整合于宿主腦組織發(fā)揮自身的腫瘤抑制作用，又可以發(fā)揮上述基因的腫瘤殺傷作用［5－6］，且其移植方式呈多樣化，在實驗和臨床應(yīng)用中都較為方便．因此，本研究首先對間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)條件進行了探索，實現(xiàn)了其體外分離及擴增，獲得了生長狀態(tài)良好、較純化和足夠數(shù)量的形似BMSCs細(xì)胞，并根據(jù)其細(xì)胞表面分子鑒定結(jié)果鑒定其確為BMSCs，接著從體外實驗探討了BMSCs對膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞的趨向性和慢病毒對其的可感染性，為進一步探明BMSCs作為基因或者藥物載體對抗膠質(zhì)瘤的可能性奠定了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，4周齡，體質(zhì)量（120±20）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物實驗符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)．

1．1．2 細(xì)胞 膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞系，本實驗室保存．

1．1．3 主要試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶，二甲基亞砜（DMSO），分別購自Hyclone、Gibco公司，PE標(biāo)記的抗大鼠 CD11b／c、CD90，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗大鼠CD29、CD45，購自 eBioscience公司．慢病毒載體、凝聚胺（polybrene）購自紐恩（上海）生物科技有限公司．

1．2 方法

1．2．1 BMSCs的體外分離、培養(yǎng)和純化 采用頸椎脫臼法處死4周齡SD大鼠，75%乙醇中浸泡10 min；在超凈工作臺中取下雙后肢，逆向解剖法游離股骨和脛骨，PBS清洗3次；剪掉股骨和脛骨的骨垢端，暴露骨髓腔，用添加了胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、維生素C及青、鏈霉素的DMEM／F12培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)吹打；然后經(jīng) 200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，1 000 r／min離心5 min，棄上清重懸后采用全骨髓培養(yǎng)法接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1．5 h后小心吸取培養(yǎng)液后全量換液，48～72 h后再全量換液一次，利用 BMSCs的貼壁特性洗去不貼壁的其它細(xì)胞，之后每3～4 d全量換液；待細(xì)胞密度長至 80%～90%時，0．25%胰酶消化 2 min，按1∶3比例傳代；此后通過BMSCs可貼壁但不緊密的特性不斷換液、傳代以純化細(xì)胞，每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況、形態(tài)變化及拍照．

1．2．2 BMSCs的鑒定 通過換液、傳代不斷純化的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定后，取第6～10代形態(tài)相符、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行 BMSCs特異性分子表面標(biāo)記鑒定：0．25%胰酶消化，1 000 r／min離心5 min，PBS洗3次后進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，使每管細(xì)胞數(shù)約1×105個，之后每管分別加入 CD11b／c、CD29、CD45及CD90單克隆抗體，同時設(shè)陰性對照．在4℃條件下孵育30 min，PBS清洗3次后以500 μL PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進行檢測分析．

1．2．3 BMSCs與膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87MG共培養(yǎng)時的旁觀者效應(yīng) 分別按1∶10、1∶100和 1∶1 000的比例將BMSCs和U87MG共培養(yǎng)，觀察BMSCs是否有趨向U87MG生長的趨勢及旁觀者效應(yīng)，并確定兩種細(xì)胞的最佳比例．

1．2．4 慢病毒載體對 BMSCs可感染性的確定 慢病毒感染BMSCs前兩天，將BMSCs以1∶3的比例傳至六孔板中，使細(xì)胞在慢病毒感染時達到 70% ～80%的融合；感染前，棄原培養(yǎng)基，用含有6 mg／L凝聚胺（Polybrene）的0．5 mL新鮮培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞表面，每孔分別加入5 μL、10 μL、15 μL、20 μL慢病毒懸液，37℃孵育，期間不斷緩慢晃動培養(yǎng)板；4 h后加入1．5 mL新鮮培養(yǎng)基以稀釋 Polybrene；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)．因慢病毒含有EGFP，一般轉(zhuǎn)染48 h后可見明顯熒光表達，72 h后更加明顯．

1．2．5 BMSCs的凍存及復(fù)蘇 取已經(jīng)過鑒定，生長旺盛且已基本長滿培養(yǎng)皿底的第3～4代 BMSCs細(xì)胞消化，用培養(yǎng)基清洗3次，最后用1 mL DMSO與胎牛血清（FBS）（DMSO：FBS為1∶10）懸浮細(xì)胞，混勻后加入凍存管中，BMSCs的終濃度大約為 2．5×109cells／L，4℃靜置30 min后于 －20℃保存2 h，再置于－80℃冰箱過夜后放入液氮罐中長期保存．6個月后，將凍存管從液氮罐中取出后迅速置于 37℃溫水中，搖動使其快速融化后將全部細(xì)胞凍存液移入 5 mL培養(yǎng)基，混勻后1 000 r／min離心5 min，棄上清重懸后全部接種于 10 cm培養(yǎng)皿中，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長增殖情況及形態(tài)學(xué)變化．

2 結(jié)果

2．1 BMSCs的原代、傳代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)變化 采用全骨髓培養(yǎng)法，3 d首次換液后，出現(xiàn)個別貼壁細(xì)胞，呈三角形或星形，也有橢圓形、短梭形，且伸出長短不一、粗細(xì)不等的胞質(zhì)突起相互連接（圖 1）．接種 5 d后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加并形成細(xì)胞團，常為短梭形、橢圓形．7～8 d后鋪滿10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿．用0．25%胰蛋白酶消化后傳代至新培養(yǎng)皿．傳代后細(xì)胞形態(tài)更趨于BMSCs典型形態(tài)，且細(xì)胞生長速度明顯加快，約3～5 d可鋪滿皿底．根據(jù)BMSCs貼壁且不緊密的特性，傳代時需嚴(yán)控消化時間以不斷提高BMSCs純度，當(dāng)傳至第 5～6代時，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，純度較高，多呈放射狀成纖維細(xì)胞樣，平行排列或呈旋渦狀生長（圖2）．

圖1 BMSCs的原代培養(yǎng)

圖2 BMSCs的傳代培養(yǎng)

2．2 BMSCs的表面標(biāo)記分子的流式鑒定 我們根據(jù)細(xì)胞治療國際協(xié)會（International Society for Cellular Therapy，ISCT）規(guī)范的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子標(biāo)準(zhǔn)，再結(jié)合大量外文文獻結(jié)果，最終選擇了 PE標(biāo)記的CD11b／c、CD90和FITC標(biāo)記的CD29、CD45四種分子對所分離出的細(xì)胞進行了表面標(biāo)記分子鑒定．結(jié)果顯示，所分離細(xì)胞 CD29和CD90表達呈陽性，而CD11b／c和CD45表達呈陰性（圖 3），確定分離細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞．

圖3 BMSCs的細(xì)胞表面標(biāo)記分子鑒定

2．3 BMSCs與膠質(zhì)瘤 U87MG共培養(yǎng)時的旁觀者效應(yīng) 經(jīng)過篩選，我們在BMSCs與U87MG接種比例為1∶100的實驗中觀察到了比較明顯的旁觀者效應(yīng)，可見BMSCs有趨向U87MG生長的趨勢，且與單獨培養(yǎng)U87MG細(xì)胞組相比，BMSCs本身對 U87MG的生長有抑制作用，BMSCs周圍的 U87MG數(shù)量明顯偏低（圖4）．

2．4 慢病毒載體對 BMSCs可感染性的確定 在驗證 BMSCs具有靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的功能之后，為進一步驗證其是否可以作為載體攜帶各種目的基因而使其對膠質(zhì)瘤發(fā)揮治療作用成為可能，又因為慢病毒對轉(zhuǎn)染細(xì)胞病理作用小，對一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞及不分化的細(xì)胞等有較高的感染效率，可攜帶基因的片段大，所以我們選取了慢病毒對其進行了可感染性的確定．結(jié)果表明，慢病毒可成功感染我們分離鑒定出的BMSCs（圖5），為其以后的研究和應(yīng)用提供了實驗依據(jù)．

圖4 BMSCs與 U87MG共培養(yǎng)時的旁觀者效應(yīng)

圖5 慢病毒對BMSCs可感染性的確定

2．5 BMSCs的凍存及復(fù)蘇 BMSCs經(jīng)過 6個月的液氮凍存后復(fù)蘇培養(yǎng)，在形態(tài)學(xué)和生長狀況方面與凍存前沒有明顯差別，均呈成纖維細(xì)胞樣（圖6）．

圖6 凍存的 BMSCs復(fù)蘇培養(yǎng)3 d后

3 討論

快速、無污染地獲得大鼠股骨和脛骨是制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的先決條件，但鮮有文獻對這一看似簡單的操作進行具體描述．雖然有個別研究者也發(fā)表過類似報道［7］，但其方法操作速度慢且容易損傷股骨和脛骨，不能成為簡捷統(tǒng)一的方法．我們參考了付必莽等［8］的逆向解剖法，可迅速游離出大鼠的股骨和脛骨．以鑷子固定骨骼后再以剪刀沿骨干逆肌肉走向進行“剪合-滑動-折轉(zhuǎn)”3個動作，即可以完全清除附著于股骨和脛骨的肌肉，且用時很短．后面細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)的結(jié)果也表明，細(xì)胞生長旺盛且形態(tài)、活力無明顯下降，證實了本方法的可行性．這種方法易于重復(fù)操作、快捷實用，在能完全清除附著在股骨和脛骨上肌肉的同時解決了損傷和污染骨髓腔的問題，顯著減少了長時間缺血對骨髓細(xì)胞的影響，為后面對 BMSCs的研究提供了良好的基礎(chǔ)．

我們采取的全骨髓培養(yǎng)法操作簡單，對細(xì)胞損傷小，能被廣泛應(yīng)用［9］．雖然傳統(tǒng)的方法所分離的原代培養(yǎng)物中除了成纖維細(xì)胞樣的 BMSCs外還有巨噬細(xì)胞、造血細(xì)胞以及紅細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，但我們通過不銹鋼網(wǎng)過濾、1．5 h換液去除黏附能力弱的雜質(zhì)細(xì)胞和組織碎片，有效地提高了BMSCs的純化效率．隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分被大量消耗，培養(yǎng)物中還積累了大量的活性細(xì)胞代謝產(chǎn)物以及壞死細(xì)胞的裂解產(chǎn)物等有害物質(zhì)和一些雜質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，影響了 BMSCs的生長和干性維持［10］．我們又通過 48～72 h再次全量換液，去除了這些培養(yǎng)基中的不利成分，提供了一個適合 BMSCs生長增殖的有利環(huán)境．我們首次利用 24 h和 48～72 h兩次全量換液法，在原代即獲得了形態(tài)均一、性狀穩(wěn)定的BMSCs，且操作快捷簡單，為對BMSCs進行后續(xù)研究和將其作為種子細(xì)胞提供了實驗基礎(chǔ)．

BMSCs的表面抗原并不是獨特的，它同時具有間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等多種細(xì)胞的表面抗原．一般認(rèn)為，整合素家族蛋白 CD29、細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族蛋白 CD44、CD90、CD105等是BMSCs的重要標(biāo)志物［11］，而其不表達造血細(xì)胞的表面抗原，如 CD11b、CD34、CD38和 CD45等．我們再結(jié)合國際細(xì)胞治療學(xué)會間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會提出的 BMSCs的標(biāo)準(zhǔn)［12］，最后選取了 BMSCs表達的陽性指標(biāo)CD29和CD90，和表達陰性的指標(biāo) CD11b／c和 CD45作為鑒定參考指標(biāo)．流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示，我們分離出的細(xì)胞確實符合 BMSCs的表面標(biāo)志物特征．

有研究表明，BMSCs對部分腫瘤有明顯的趨向性，并且能發(fā)揮自身的腫瘤抑制作用或通過介導(dǎo)特定細(xì)胞因子來抑制腫瘤的生長［13］．此外，其還能克服許多病毒載體的缺陷，又具有分離方便、低免疫原性和易基因修飾等特點，其作為載體在攜帶藥物和目的基因抗腫瘤的研究中越來越具有潛力［14］．因此，驗證其對腫瘤細(xì)胞的趨向性十分有必要．我們通過體外共培養(yǎng)探討了 BMSCs對膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞的趨向性，結(jié)果表明其可靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞并發(fā)揮一定的腫瘤細(xì)胞抑制作用，又以慢病毒對其進行感染確定了其可攜帶目的基因的可能性，為進一步將其作為載體治療膠質(zhì)瘤提供了支持．

綜上所述，BMSCs在細(xì)胞替代治療及基因治療腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視．目前對其的研究和應(yīng)用尚處于初級階段，隨著對其研究的不斷深入，BMSCs在不久的將來一定會成為抗腫瘤治療的有力工具和途徑．

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Isolation and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells and its contribution in the treatment of glioma

LIU Hui，ZHANG Peng-Xing，F(xiàn)AN Fei-Yan，LIU Nan，REN Dong-Ni，ZHANG Yong-Sheng，TU Yan-Yang
Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710038，China

AIM：To establish a method of isolating，cultivating and purifying rat bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in vitro，to indentify cell morphology and cell surface markers，to investigate the tropism of BMSCs towards U87MG glioma and infection of lentiviral vector to BMSCs，to provide the experimental evidence for the gene therapy and medication of glioma with BMSCs acting as vectors．METHODS：BMSCs keeping strong growth and stable morphology from rats were isolated，cultured and purified by the whole bone marrow adherence method combined with the different adherent capacities of kinds of cells and the cells morphology observations．Then the cell surface markers were assessed by flow cytometry．BMSCs were co-cultured with U87MG to investigate their tropism towards U87MG glioma and infected with the lentiviral vector to verify their potentiality for gene therapy．RESULTS：The isolated BMSCs were fibroblastlike，showing radial colony arrangement．Cells could keep strong growth and passage in continuous and stable manner over passages．According to the FCM，BMSCs were positive for CD29 and CD90，but negative for CD11b／c and CD45．After being co-cultured with U87MG with the ritio of 1∶100，BMSCs had significant tropism towards U87MG and restrained the U87MG growth to some extent．Also，the lentiviral vector infected BMSCs successfully with high rate of infection．CONCLUSION：Our method is simple and can isolate，purify and amplify BMSCs in vitro and BMSCs have a tropism towards U87MG glioma and can be infected by the lentiviral vector．All these results provide adequate source of seed cells for further study of BMSCs and experimental evidence for gene therapy and medication of glioma with BMSCs as vectors．

bone marrow mesenchymal stem cells；isolation；i-

R739．4

A

2095-6894（2015）01-010-05

2014-12-28；接受日期：2015-01-19

國家自然科學(xué)基金青年項目（81101736）

劉 輝．碩士．研究方向：膠質(zhì)瘤的基因治療．Tel：029-84778169 E-mail：liuhui13209@163．com

張永生，涂艷陽．E-mail：tu．fmmu@gmail．com