氫氟酸酸蝕形成的兩種不同微/納米表面對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響

申明明, 李艷榮, 齊亞平, 付 亁, 秦東澤, 梁建飛, 趙云轉(zhuǎn)

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科, 河北 石家莊 050000; 2. 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科一病區(qū), 北京 100853; 3. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院, 陜西 西安 710032)

氫氟酸酸蝕形成的兩種不同微/納米表面對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響

申明明1, 李艷榮2, 齊亞平1, 付 亁3, 秦東澤3, 梁建飛3, 趙云轉(zhuǎn)1

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科, 河北 石家莊 050000; 2. 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科一病區(qū), 北京 100853; 3. 軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院, 陜西 西安 710032)

目的: 評(píng)價(jià)純鈦樣品經(jīng)12.5 g/L氫氟酸(HF)酸蝕處理不同時(shí)間后形成的兩種不同表面對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)生物活性的影響。方法：將純鈦鈦片平均分為3組：A組拋光處理；B組12.5 g/L HF酸蝕1 min；C組12.5 g/L HF酸蝕15 min。X射線能譜儀分析(EDS)其表面化學(xué)成分；親水性試驗(yàn)測(cè)量樣品表面的接觸角；激光共聚焦顯微鏡計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)BMMSCs在樣品表面的早期黏附；SEM觀察觀察樣品表面形貌及黏附的細(xì)胞形態(tài)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測(cè)定ALP活性。結(jié)果：酸蝕后的兩組樣品都可形成微/納米級(jí)表面形貌且載入氟元素；酸蝕后的表面接觸角明顯小于拋光組，且C組小于B組；酸蝕后的純鈦樣品表面能夠促進(jìn)BMMSCs的黏附、增殖和ALP活性，且C組優(yōu)于B組。結(jié)論：HF酸蝕使純鈦表面構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)的微/納米形貌，載入了氟元素，可促進(jìn)BMMSCs在純鈦表面的生物活性。

氫氟酸(HF); 酸蝕; 微/納米; 表面處理; 生物活性

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.004

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8): 472]

隨著口腔種植學(xué)的飛速發(fā)展，種植牙在臨床上受到了患者和醫(yī)生的普遍歡迎。然而，口腔種植仍面臨著治療周期過(guò)長(zhǎng)、骨質(zhì)骨量不佳、種植成功率低等問(wèn)題。目前認(rèn)為，種植體的成功率主要取決于種植體與周圍骨組織的結(jié)合，為提高種植體骨結(jié)合效果，縮短骨結(jié)合時(shí)間，學(xué)者們嘗試了很多方法，其中對(duì)種植體進(jìn)行表面處理被認(rèn)為是促進(jìn)種植體骨結(jié)合最有效的方法之一。種植體表面處理的方法有很多種，其中酸蝕法因其操作簡(jiǎn)單、設(shè)備低廉等原因，一直廣受關(guān)注。目前常用的酸有HCl、HNO3等，由于在酸蝕的同時(shí)可載入具有促成骨作用的氟元素，使得氫氟酸(HF)成為目前對(duì)種植體進(jìn)行表面處理的研究熱點(diǎn)。然而現(xiàn)有的研究對(duì)于HF酸蝕的濃度和作用時(shí)間無(wú)較精確的標(biāo)準(zhǔn)，加之酸蝕后的表面形貌不能夠較精確地控制，所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用12.5 g/L HF對(duì)鈦片酸蝕不同時(shí)間，對(duì)其形成的表面形貌及其對(duì)BMMSCs生物活性的影響進(jìn)行研究，以期為HF進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品制備和分組處理

取純鈦片(Φ14 mm×0.5 mm，西安中邦生物鈦有限公司)用#200、#800、#1 200、#2 000、#3 000、#5 000水相砂紙依序打磨拋光，再依次用丙酮、無(wú)水乙醇及去離子水分別超聲清洗15 min。然后將鈦片樣品隨機(jī)分為A、B、C 3組，其中A組樣品不予任何處理；B組樣品置于12.5 g/L HF中酸蝕1 min(30 ℃，200 r/min)、C組樣品置于12.5 g/L HF中酸蝕15 min(30 ℃，200 r/min)，并于酸蝕完成后，將B、C兩組鈦片依次用丙酮、無(wú)水乙醇及去離子水分別超聲清洗15 min。上述所有樣品分別經(jīng)鈷60消毒后備用。

1.2 樣品表面形貌觀察及化學(xué)成分檢測(cè)

分別取A、B、C各組樣品，用掃描電鏡(JSM-6460，Hitachi，日本)觀察其表面形貌；并用X射線能譜儀(JSM- 6460，Hitachi，日本)分析樣品表面的化學(xué)組成。

1.3 樣品表面接觸角測(cè)量

接觸角測(cè)量采用液滴法，于室溫下在接觸角測(cè)量系統(tǒng)及其配套軟件(Easy-Drop Standard，Kruss，德國(guó))上完成。具體方法如下：取A、B、C各組樣品，分別在其表面滴8 μL去離子水，然后采用數(shù)字成像技術(shù)采集液滴影像，并通過(guò)系統(tǒng)附帶的DSAl軟件分析液滴形狀而測(cè)得接觸角；記錄結(jié)果為液滴左右雙側(cè)接觸角的平均值，每個(gè)試樣各測(cè)量5次。

1.4 BMMSCs原代培養(yǎng)

取人的髂骨骨松質(zhì)(知情同意)，PBS沖洗3～5次，將血細(xì)胞沖掉，剪刀剪碎，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM, 含100 mL/L新生牛血清(Gibco, 美國(guó))和10 g/L青/鏈霉素。置于37 ℃、50 mL/L CO2濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至2～5代用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

將各組樣品置于24孔板中，接種密度為2×104/孔，細(xì)胞培養(yǎng)4 d后PBS和雙蒸水輕柔漂洗，然后加入30 mL/L戊二醛、4 ℃過(guò)夜，乙醇梯度脫水、干燥和噴金后, SEM觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將鈷60消毒后的樣品置于24孔板內(nèi)，細(xì)胞接種前24孔板紫外線照射30 min。細(xì)胞接種密度為2×104/孔，分別于培養(yǎng)30、60、120 min后，將鈦片轉(zhuǎn)移至新24孔板，PBS漂洗3次以去掉未黏附的細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min。PBS再次漂洗3次后，每孔加入200 μL DAPI工作液，37 ℃避光孵育15 min；PBS漂洗3次，4 ℃避光保存，激光共聚焦顯微鏡(FV1000, Olympus, 日本)下隨機(jī)選擇4個(gè)視野觀察并拍照。

1.7 細(xì)胞活性檢測(cè)

將0.306 g β-甘油磷酸鈉溶于10 mL培養(yǎng)液，加20 μL地塞米松和0.167 mL維生素C配制成100 mL成骨誘導(dǎo)液。將各組樣品置于24孔板中，接種密度為 2×104/孔，第2天換成骨誘導(dǎo)液后，分別培養(yǎng)1、4、7 d，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。到預(yù)定時(shí)間點(diǎn)后，PBS漂洗3次并轉(zhuǎn)移至新的24孔板內(nèi)，每孔加入200 μL的MTT(5 mg/mL)和800 μL無(wú)血清無(wú)酚紅的DMEM。37 ℃孵育4 h后棄上清，加入1 mL DMSO，每孔分3份轉(zhuǎn)移至96孔板(每孔200 μL)，分光光度計(jì)檢測(cè)各孔490 nm處的吸光度值(OD值)。

1.8 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)

將各組樣品置于24孔板中，接種密度為2×104/孔，細(xì)胞分別培養(yǎng)7、14 d后，用ALP試劑盒檢測(cè)各孔細(xì)胞的ALP活性，分光光度計(jì)檢測(cè)各孔405 nm處的OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同處理后鈦片樣品的表面形貌

SEM低倍鏡下可見(jiàn)，A組拋光鈦片表面出現(xiàn)沿拋光方向平行排列的溝槽；B組酸蝕后表面形成縱橫不一的溝壑，同一個(gè)晶格內(nèi)溝壑方向一致，溝壑寬度約0.5 μm；C組酸蝕后表面形成寬度為1.5～2 μm 的溝壑，晶格界限清晰，同一個(gè)晶格內(nèi)溝壑方向一致。高倍鏡下可見(jiàn)，A組表面細(xì)微的平行排列的溝槽；B組表面形態(tài)均一，在微米結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)直徑為20～40 nm的點(diǎn)狀顆粒，鄰接緊密，頂部較尖銳；C組表面形態(tài)均一，為較疏松的山峰狀結(jié)節(jié)，直徑為70～100 nm，邊緣較圓鈍(圖1)。

圖1 SEM觀察不同處理組鈦片表面(a～c為×5 000; d～f為×50 000)

2.2 不同處理組樣品表面的化學(xué)成分

X射線能譜儀分析結(jié)果顯示，A組表面主要含Ti元素，以及少量的O、C、Si。B組表面除了O、C、Si、Ti外，還有少量的F，其中F占1.79%，Ti占79.15%。C組與B組類似，其中F占1.81%，Ti占78.47%(表1)。

周家喜讓執(zhí)法船趕緊向漁船靠攏，逼停漁船，登船檢查。他發(fā)現(xiàn)船上江豚保護(hù)區(qū)禁止使用的非法捕撈工具，便要依法收繳。船上三人急了，想動(dòng)手搶奪漁網(wǎng)，拉扯中險(xiǎn)些跟周家喜發(fā)生沖突。

2.3 樣品表面接觸角測(cè)量

A組接觸角最大，B、C組明顯小于A組，其中C組最小，B組居中。A組表面接觸角為 40.5±0.65，B組為13.7±1.59，C組為11.8±1.07。

2.4 樣品表面BMMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

SEM觀察結(jié)果顯示，與酸蝕組相比，A組表面細(xì)胞伸展更好(圖2a)；B、C組表面細(xì)胞伸出大量偽足，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形；與B組(圖2b)相比，C組(圖2c)表面更多的細(xì)胞呈現(xiàn)大量偽足的形態(tài)，且細(xì)胞之間偽足連接較多。

表1 不同處理組表面化學(xué)成分 (%)

圖2 SEM觀察不同處理組鈦表面BMMSCs黏附情況(×1 000)

2.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

2.6 細(xì)胞活性檢測(cè)

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：3種鈦片表面的BMMSCs均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，1、4 d時(shí)3組兩兩相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；7 d時(shí)，B、C組顯著高于A組，且C組高于B組(P<0.05)(圖5)。

圖3 不同處理組鈦片表面BMMSCs的早期黏附(共原焦顯微鏡, ×10)

同一時(shí)間點(diǎn)組間兩兩相比P<0.05

7 d時(shí)組間兩兩相比P<0.05

2.7 ALP活性

培養(yǎng)7 d時(shí)，3組樣品表面BMMSCs的ALP活性檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；14 d時(shí)，B、C組表面BMMSCs的ALP活性均顯著高于A組，且C組高于B組(P<0.05)(圖6)。

14 d時(shí)組間兩兩組相比P<0.05

3 討論

目前，用于種植體表面處理的方法多種多樣，其中酸蝕作為臨床種植體表面處理最簡(jiǎn)單有效的方法之一，不僅可達(dá)到微/納米的仿生結(jié)構(gòu)，而且表面更為清潔，操作簡(jiǎn)單，成本低，適用于批量生產(chǎn)。目前常用的酸有HCl、HNO3、HF等，其中HF在酸蝕的過(guò)程中可以載入氟元素，研究表明氟化物具有促進(jìn)成骨基因表達(dá)及骨礦化的作用[1]，因此能進(jìn)一步提高種植體的骨結(jié)合率。但目前對(duì)于HF酸蝕的具體參數(shù)以及控制條件尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

骨組織的微觀結(jié)構(gòu)由微米級(jí)和納米級(jí)的結(jié)構(gòu)組成[2]，因此從仿生學(xué)的角度來(lái)講，在種植體表面構(gòu)建微/納米梯度有序的表面，能更接近骨的仿生結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提高種植體的骨結(jié)合率。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)12.5 g/L HF酸蝕后的純鈦表面，在形成微米級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還有納米級(jí)結(jié)構(gòu)的存在。這種微、納米分層的結(jié)構(gòu)使種植體表面更接近骨組織的特點(diǎn)。HF酸蝕除了影響種植體表面形貌以外，還對(duì)種植體表面原有的化學(xué)成分產(chǎn)生了一定的影響，經(jīng)過(guò)HF酸蝕后，純鈦表面載入了氟元素。氟進(jìn)入骨組織后能直接刺激成骨細(xì)胞增生，促進(jìn)新骨形成，以充填破骨細(xì)胞吸收形成的陷窩，使骨小梁增厚，骨量增加。本結(jié)果顯示，HF酸蝕后的鈦片表面均載入一定的氟元素，隨著HF酸蝕時(shí)間的增加，氟的含量由1.79%增加到1.81%，但氟元素的量與HF酸蝕的時(shí)間以及表面形貌無(wú)明顯規(guī)律，可能由于表面粗糙度的差異，或與氟化物在純鈦表面沉積和結(jié)合的方式有關(guān)。

種植體的表面形貌對(duì)骨結(jié)合起重要作用，它不僅直接影響所吸附生物分子的種類、形態(tài)和構(gòu)象，而且影響組織細(xì)胞的黏附、增殖、分化和基質(zhì)的合成、鈣化等一系列生理過(guò)程。本結(jié)果顯示：HF酸蝕后的表面形成微/納米結(jié)構(gòu)，B組表面溝壑寬度約為0.5 μm，顆粒直徑為20～40 nm，C組表面溝壑寬度為1.5～2.0 μm，顆粒直徑為70～100 nm。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)粗糙度值在0.5～2.0 μm時(shí)，不僅能夠增加種植體-骨接觸面積，而且能有效增加早期的種植體-骨界面的生物機(jī)械嵌合。體外實(shí)驗(yàn)提示，在1.50～3.62 μm 的種植體表面更利于成骨細(xì)胞附著生長(zhǎng)，微米級(jí)涂層可增加種植體與周圍骨組織的機(jī)械性結(jié)合并具有一定的生物學(xué)活性[2]。另外，當(dāng)上皮基底膜的毛孔為70～100 nm，骨表面粗糙度約為32 nm時(shí)，可促進(jìn)成骨基因如Runx2、ALP、骨涎蛋白在納米級(jí)表面表達(dá)水平升高，同時(shí)IGF-2、BMP2、BMP6也有更強(qiáng)的表達(dá)[1]，證實(shí)了納米級(jí)涂層表面可明顯增加新骨的形成以及種植體的骨結(jié)合率[3]。本結(jié)果顯示，拋光組更加有利于細(xì)胞的伸展，可能是顆粒的高密度會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的伸展。細(xì)胞最初的偽足在100 nm左右，可能是C組偽足較多的一個(gè)原因。因此，種植體表面的納米改性可更好的模擬細(xì)胞環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)，微米結(jié)構(gòu)可提供細(xì)胞、能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸通道，微/納米級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于提高骨整合均有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，二者協(xié)同有助于更好地促進(jìn)新骨形成[4]。

氟可以TiFx的形式存在，也可以更復(fù)雜的TiOxFy或TiFxOH形成存在[5]。氟離子滲透到鈦表面形貌后，氟化物可作為儲(chǔ)備發(fā)揮潛在的成骨作用，刺激成骨細(xì)胞的基因表達(dá)[6]，提高骨整合。有學(xué)者認(rèn)為，HF酸蝕后種植體表面的羥基化合物、氟化物、氫化物和氧化物的含量和存在形式，以及由其產(chǎn)生的微/納米形貌綜合影響生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和骨再生[7], HF處理后的種植體可促進(jìn)種植體表面骨的快速生成。這其中氟元素是否起到了促進(jìn)成骨的作用還需進(jìn)一步研究。

細(xì)胞黏附作為良好骨整合的前提條件至關(guān)重要。材料表面良好的潤(rùn)濕性可以增加與細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)[8]。當(dāng)種植體植入體內(nèi)后，首先與體液和組織細(xì)胞相接觸。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，影響細(xì)胞黏附的蛋白在不同的潤(rùn)濕性表面有不同的量和結(jié)構(gòu)[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，疏水性的材料表面和蛋白質(zhì)表面促進(jìn)蛋白吸附，這可能是親水性表面互相吸附時(shí)需要置換掉表面吸附的水分子，比疏水性表面多了能量障礙[10]。本結(jié)果顯示，酸蝕組有更好的親水性且更加有利于細(xì)胞的黏附、增殖和ALP活性，細(xì)胞黏附作為細(xì)胞與種植材料相互作用的第一步，會(huì)影響細(xì)胞后期的增殖、分化和骨基質(zhì)形成，C組表面細(xì)胞的增殖和ALP活性均高于B組，這可能與最初的細(xì)胞黏附有關(guān)，也可能間接受表面吸附蛋白的影響。

純鈦經(jīng)12.5 g/L HF酸蝕后在載入氟元素的同時(shí)形成了微/納米級(jí)的表面形貌，隨著酸蝕時(shí)間的變化，會(huì)影響表面微/納米形貌的尺寸，從而進(jìn)一步影響表面黏附細(xì)胞的生物學(xué)活性。對(duì)于體內(nèi)成骨的效果，以及能否通過(guò)改變HF酸蝕參數(shù)，進(jìn)而找到一個(gè)最佳濃度和時(shí)間的范圍，以實(shí)現(xiàn)更加有效的成骨作用，有待于進(jìn)一步研究及探索。

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Effects of hydrofluoric acid-treated titanium micro/nano surface on the biological activity of bone marrow mesenchymal stem cells

SHEN Ming- ming*, LI Yan- rong, QI Ya- ping, FU Qian, QIN Dong- ze, LIANG Jian- fei, ZHAO Yun- zhuan

(*DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

AIM: To evaluate the effects of hydrofluoric (HF) acid- treated titanium surfaces on the biological activity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs). METHODS: Titanium plates were divided into 3 groups, the suface of the samples was polished in group A, etched by 12.5 g/L HF acid for 1 min group B and etched by 12.5 g/L HF acid for 15 min Group C. The surface of the sample was observed by scanning electron microscopy (SEM). The suxface chemical composition was assessed by energy dispersive X- Ray spectroscopy detector (EDS). Contact angles were detected by drop method . BMMSCs adhesion and morphology were examined by confocal microscopy and SEM. Cell viability and ALP activity were assessed by MTT assay and ALP detection kit. RESULTS: Micro/nano-scale surface structures were formed after HF etching. The sample surfaces of group B and C were loaded with fluorine. Contact angle of etching groups was significantly smaller than that of polishing group. HF- treated titanium surfaces significantly promoted adhesion, proliferation and ALP activity of BMMSCs. Furthermore, the effects of group C was greater than those of group B. CONCLUSION: HF acid-etch may forme different size of micro/nano- scale structures and load with fluorineon on titanium surface; can improve the biological activity of BMMSCs.

HF; acid etching; micro/nano; surface modification; biological activity

2014-09-16;

2015-06-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371186)

申明明(1986-)，女，漢族，河北人。碩士生(導(dǎo)師：趙云轉(zhuǎn))

趙云轉(zhuǎn)，E-mail：zhyzh2962@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0472-06