甜茶果實(shí)水提物HPLC分析及抗氧化性分析

湛志華　薛茗月　李曉紅　陳全斌　馬劍霜

摘 要 甜茶果實(shí)的水提取物經(jīng)高效液相色譜檢測未發(fā)現(xiàn)有山奈酚、槲皮素等甜茶植株中常見的黃酮苷元，但發(fā)現(xiàn)含有鞣花酸，測定其含量約為0.58%。采用紫外可見光分光光度法分析了甜茶果實(shí)提取物的抗氧化能力，結(jié)果表明，甜茶果實(shí)提取物具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，其清除自由基能力和抗氧化能力均比人工合成抗氧化劑BHT強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 甜茶；果實(shí)；化學(xué)成分；分離純化

中圖分類號(hào)：S571；S663.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）30--03

食品添加劑的安全性和毒副作用隨著人類生活水平的提高和綠色工業(yè)的興起而越來越受到關(guān)注，BHA、BHT、TBQH等常用合成抗氧化劑的使用則越來越受到限制。因此，從天然產(chǎn)物中尋找毒副作用小安全性高的天然抗氧化劑已成為近年來的研究熱點(diǎn)。大量研究顯示[1， 2]廣西甜茶中含有黃酮類和酚酸類天然抗氧化活性物質(zhì)。廣西甜茶（Leaf of Strigose Hydrangea）是薔薇科懸鉤子屬植物，是廣西特產(chǎn)。陳全斌等[3， 4]從甜茶中分離得到了鞣花酸、黃酮苷元槲皮素和山奈酚。鞣花酸是一種植物多酚類化合物，已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)其可以抗衰老、增加肌體免疫，具有較強(qiáng)的防癌功效，且能抗脂質(zhì)過氧化、抗誘變及捕捉自由基，是一種亟待開發(fā)的天然抗氧劑[5]。陳全斌等已對(duì)甜茶植株的根、莖、葉和花中黃酮苷元及鞣花酸含量進(jìn)行了測定，而整個(gè)植株中黃酮及鞣花酸的分布規(guī)律、甜茶果提取物抗氧化能力等課題有待進(jìn)一步深入研究。本文利用高效液相色譜對(duì)甜茶果實(shí)的水提物進(jìn)行HPLC分析，采用紫外可見光分光光度法分析了甜茶果水提精制樣品的抗氧化活性，并與合成抗氧化劑2、6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料與試劑

甜茶果（廣西金秀）、甲醇、硫酸、磷酸鈉、鹽酸、磷酸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、BHT、二苯代苦味酰自由基（DPPH）、鈷酸銨、山奈酚和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma-Aldrich）。

1.1.2 儀器

P200Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特公司）、HHSⅡ-4型電熱恒溫水浴鍋、722型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、E-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、BP211D型電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC分析甜茶果實(shí)水提酸解產(chǎn)物

甜茶果水提酸解樣品的制備：破碎烘干甜茶果實(shí)樣品1 g→加入氯仿25 mL回流30 min→過濾→真空干燥濾渣→甲醇30 mL回流1 h→過濾→濾液與10 mL1∶1HCl溶液混合→加熱水解1 h→甲醇定容至50 mL待測。

甜茶果水提液樣品制備：準(zhǔn)確稱取干燥甜茶果1.020 g粉碎→加入150 mL蒸餾水回流提取3 h→定容至500 mL。

黃酮苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別配制濃度為0.1563 mg/mL的山奈酚和0.1324 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后1∶1混合。

0.1 mg/mL鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg→甲醇溶解并定容至100 mL。

HPLC色譜條件：Hypersil ODS（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動(dòng)相V甲醇∶V水∶V磷酸=60∶40∶0.3；流速1.0 mL/min；在波長360 nm處檢測黃酮類物質(zhì)，在波長270 nm處檢測鞣花酸；柱溫30 ℃；靈敏度0.005；進(jìn)樣20 μL。

1.2.2 樣品成分HPLC分析

分別準(zhǔn)確吸取甜茶果水提酸解待測溶液和黃酮苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液20 ?L進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)保留時(shí)間定性方法，以確定甜茶果中黃酮苷元的成分及含量見圖1。

采用工作曲線法測定甜茶果中鞣花酸的含量。通過外標(biāo)法測定鞣花酸的質(zhì)量（μg）和峰面積（mv.min）之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖2（a）所示，樣品色譜圖見圖2（b）。根據(jù)HPLC保留時(shí)間定性方法確定圖2（a）中t=5.24min處的吸收峰對(duì)應(yīng)物質(zhì)為鞣花酸。經(jīng)計(jì)算，甜茶果中鞣花酸含量為0.58%。

1.2.3 甜茶果水提取物抗氧化性研究

甜茶果水提精制樣品制備 取干甜茶果100 g→加水（1∶10）煮沸120 min→冷卻過濾→濃縮、干燥→深褐色甜茶果粗提物→無水乙醇溶解→過濾→濃縮干燥→黃色精制樣品。

不同濃度樣品的清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)：精確稱取精制樣品，配置濃度為0.2、0.5、0.8、1.2 mg/mL的甲醇溶液；分別取0.2 mL與8 mL0.004%的DPPH甲醇溶液混合，30 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)。每10 min測定一次515 nm處的吸光度直到反應(yīng)完全；另外，測定各樣品溶液吸光度和不含甜茶果提取物的空白樣品吸光度。根據(jù)公式S（%）=（1-A樣品/A空白）×100%計(jì)算清除率，作S-t圖[圖3（a）]。配置0.5mg/mL的BHT甲醇溶液，測定同濃度下（0.5 mol/L）樣品與BHT的吸光度，作S-t圖[見圖3（b）]。

甜茶果水提物總抗氧化性實(shí)驗(yàn)從2個(gè)方面考查。一是測定樣品在不同濃度下的總抗氧化性比較，再就是特定濃度下的樣品與BHT總抗氧化性的比較。

樣品不同濃度下總抗氧化性測定：在10 mL具塞刻度比色管中依次加入甜茶果水提取物的樣品甲醇溶液1 mL，0.6M H2SO4溶液1.0 mL，0.004M（NH4）6Mo7O24溶液1.0 mL，0.028M Na3PO4溶液1.0 mL→定容至5 mL→95 ℃水浴→每30 min測一次695 nm波長處吸光度。配置0.1 mg/mL的BHT溶液做陽性對(duì)照，作A-t圖[圖4（a）]。

特定濃度下總抗氧化性測定 配置0.5 mg/mL各樣品溶液和BHT溶液，測定其吸光度，作A-t圖[圖4（b）]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜茶果水提取物HPLC分析

從圖2可以看出，甜茶葉和莖中含有槲皮素和山奈酚在甜茶果果實(shí)中沒有被檢出；果實(shí)中鞣花酸的含量為0.58%。已有文獻(xiàn)顯示，甜茶根、莖、葉、花中，鞣花酸含量分別為0.10%、0.07%、0.06%、1.85%，果實(shí)中鞣花酸的含量僅次于甜茶花中的含量，而采集甜茶花是很困難的。因此，從甜茶果實(shí)中提取分離天然抗氧化劑鞣花酸作為保健品添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 甜茶果水提物清除DPPH自由基[11]效應(yīng)

不同濃度甜茶果水提精制樣品對(duì)DPPH的清除率測定結(jié)果見圖3（a），甜茶果水提物有較強(qiáng)的清除自由基的能力，這是因?yàn)樘鸩韫缓坊ㄋ岬确铀犷惢衔?。圖3（a）顯示，隨著濃度的增大，果實(shí)提取物的自由基清除能力越大；不用濃度的樣品對(duì)自由基的清除率均在反應(yīng)前10 min就達(dá)到了最大值，隨后變化值不大，說明清除自由基的速率比較快；最大的清除率約為80%，濃度為0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大清除率，濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，清除率增加不明顯。由圖3（b）可知，BHT清除自由基速率不及甜茶果水提精制樣品，人工合成抗氧化劑BHT達(dá)到最大清除率需要反應(yīng)約70 min，而精制樣品在越10 min時(shí)即達(dá)到最大清除率，且同濃度下BHT的最大清除率小于甜茶果水提精制樣品。綜上所述，甜茶水提精制樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用要優(yōu)于BHT。

2.3 各樣品的總抗氧化性分析

不同濃度下甜茶果水提精制樣品總抗氧化能力的A-t圖見4（a）。圖4（b）為0.5mol/L樣品與BHT總抗氧化性的A-t圖。圖4顯示甜茶果水提取的精制樣品的抗氧化性較強(qiáng)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延遲及樣品濃度的增大其抗氧化能力表現(xiàn)越強(qiáng)，0.5 mol/L甜茶果水提樣品的總抗氧化性明顯優(yōu)于BHT。

3 結(jié)論

1）廣西甜茶果實(shí)中不含有槲皮素和山奈酚苷元；鞣花酸的含量為0.58%。

2）甜茶果實(shí)水提精制樣品有較強(qiáng)的清除自由基的能力，自由基清除反應(yīng)10 min后達(dá)到了最大清除率；0.5 mg/mL甜茶水提取物自由基清除速率明顯優(yōu)于0.5 mg/mL BHT，其總抗氧化的能力也比BHT強(qiáng)。

3）鞣花酸是優(yōu)秀的天然抗氧化添加劑，甜茶果實(shí)作為保健食品加以開發(fā)和利用具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]鄧紹林.廣西甜茶葉片的營養(yǎng)成分及開發(fā)利用價(jià)值研究[J].中國林副特產(chǎn)，2000（3）：18-19.

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[4]陳全斌，沈鐘蘇，張巧云.甜茶中黃酮甙元的分離提純及其表征[J].林業(yè)科技，2005，30（1）：46-48.

[5]馬書榮，曲笑巖，祖元?jiǎng)?溫室內(nèi)長春花總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化研究[J].植物研究，2006，26（2）：211-215.

（責(zé)任編輯：劉昀）