抗菌中草藥紫草的GC－MS分析

崔 錦，陳杰桃，穆 青

（復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203）

新疆紫草（Arnebia euchroma（Royle）Johnst.）是中藥紫草的主要來(lái)源之一，又名軟紫草，為紫草科（Boraginaceae）軟紫草屬多年生草本植物.紫草是我國(guó)常用中藥材，有清熱涼血、活血、解毒透疹之功效.用于血熱毒盛、麻疹不透、瘡癰腫毒、濕疹、水火燙傷等［1］.目前已從新疆紫草中分離到幾大類(lèi)化合物［2－7］，包括萘醌類(lèi)、苯酚和苯醌類(lèi)、吡咯里西啶生物堿類(lèi)、多酚酸類(lèi)、三萜酸類(lèi)和酸性多糖等，其中萘醌類(lèi)化合物因表現(xiàn)出多種重要的藥理活性而被人們廣泛關(guān)注［8］.現(xiàn)代藥理研究表明，紫草具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、治療燒傷［9－12］、抗生育、抑制前列腺素生物合成、降血糖、肝保護(hù)和抗HIV［13］等多種作用［14－15］.

隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)藥物也產(chǎn)生了各式各樣的耐藥［16－20］.多藥耐藥金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是近年來(lái)醫(yī)院內(nèi)一種常見(jiàn)嚴(yán)重的傳染病菌，已經(jīng)對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥［21］.研究開(kāi)發(fā)新類(lèi)型、新機(jī)制的抗多藥耐藥金黃葡萄球菌藥物的形勢(shì)日趨緊迫［22］.

前期研究中我們以具有norA 外泵耐藥基因的多藥耐藥金葡菌菌株SA1199B建立模型，對(duì)一些中草藥進(jìn)行了活性篩選.本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新疆紫草根的95%乙醇提取物（AEC）及石油醚提取物（AEC01）對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥菌株顯示出較好的抑制活性；對(duì)紫草乙醇粗提物進(jìn)行了氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）分析，檢測(cè)到了其中的萘醌類(lèi)特征性成分.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

紫草中藥材于2009年購(gòu)自上海華宇藥業(yè)有限公司，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院張文駒副教授鑒定為新疆紫草的根，憑證標(biāo)本保存于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院天然藥化教研室.樣品粉碎（0.193mm），取100g分別用相應(yīng)溶劑于45℃提取3次，第一次200mL，后兩次分別100mL，45℃下減壓回收溶劑，分別得到AEC（紫草乙醇提取物）、AEC01（紫草石油醚提取物）、AEC02（紫草乙酸乙酯提取物）、AEC03（紫草水溶性部位）.上述浸膏分別取所需量配制樣品溶液用于化學(xué)分析和抗菌活性測(cè)定.

1.2 GC－MS分析條件

美國(guó)Thermo Focus DSQ 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀；HP－5MS（30m×0.25mm×0.25μm）色譜柱.色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃；起始溫度60℃，保持2min；以15℃／min 升至300℃，保持5min；載氣He；流速：1mL／min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比100∶1，進(jìn)樣量：0.2μL.質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，離子源溫度250℃.傳輸線(xiàn)溫度：250℃.掃描范圍：41～400amu.質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)：NIST 庫(kù).

1.3 抗耐藥金葡菌活性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)中涉及的6 種金黃色葡萄球菌分別為：ATCC25943（普通金黃色葡萄球菌）、SA1199B（具有NorA 外泵耐藥基因的多藥耐藥菌株，它可將包括氟喹諾酮在內(nèi)的多種抗生素排出細(xì)胞外）、Xu212（具有四環(huán)素外泵蛋白的耐四環(huán)素菌株）、RN4220（具有MsrA 氨基糖苷類(lèi)外泵蛋白的耐氨基糖苷類(lèi)菌株）、EMRSA15（耐林可霉素類(lèi)抗生素）、EMRSA16（耐β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素），英國(guó)倫敦大學(xué)藥學(xué)院Simon Gibbons教授提供細(xì)菌并完成相關(guān)抑菌實(shí)驗(yàn).

待測(cè)AEC系列樣品溶液的配制：取相應(yīng)樣品用DMSO 配制成一定濃度溶液，用肉湯稀釋成所需濃度.

最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測(cè)定：測(cè)試前所有測(cè)試菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基（Oxoid）上于37℃培養(yǎng)24h.對(duì)照抗菌藥物諾氟沙星（norfloxacin）和受試化合物樣品AEC 系列樣品溶液分別以一定濃度加入相應(yīng)的孔槽中.基質(zhì)為陽(yáng)離子調(diào)節(jié)型肉湯（Cation Adjusted Mueller－Hinton Broth，CAMHB）.在37℃下培養(yǎng)18h.每一孔槽中加入5mg／mL的噻唑溴化四唑（MTT；Sigma）染色液20μL，培養(yǎng)20min.通過(guò)顏色從黃色到深藍(lán)色變化判斷細(xì)菌生長(zhǎng).根據(jù)MTT 顯色結(jié)果，導(dǎo)致細(xì)菌無(wú)生長(zhǎng)繁殖的最低藥物或樣品濃度為MIC值.

2 結(jié)果與討論

2.1 活性測(cè)試

對(duì)新疆紫草不同極性的提取物進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果表明95%乙醇提取物及石油醚提取物對(duì)耐藥金黃葡萄球菌具有顯著抑制作用，MIC值分別為4～8μg／mL 和8～16μg／mL；乙酸乙酯和水提取部位均為128μg／mL（表1），即沒(méi)有抗菌活性.

表1 紫草提取物以及不同極性部位的最低抑菌濃度Tab.1 The minimum inhibitory concentration of the ethanol extract and different polar parts fromA.euchroma

2.2 GC－MS分析

對(duì)抗菌活性最強(qiáng)的乙醇提取物AEC 進(jìn)行了GC－MS 定性分析，總離子流圖譜如圖1 所示.運(yùn)用replib，mainlib譜庫(kù)對(duì)照，以峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)百分含量.樣品AEC中鑒定出29個(gè)化合物，其中有4個(gè)特征性成分萘醌類(lèi)化合物（共計(jì)27.69%），為5，8－二羥基－1，4－萘醌（0.76%）、去氧紫草素（17.49%）、乙酰紫草素（4.11%）和異戊酰紫草素（5.33%）.樣品中存在大量脂肪烴和脂肪酸類(lèi)脂質(zhì)成分，共計(jì)67.62%.新疆紫草乙醇提取物GC－MS分析組分百分含量得到的結(jié)果如表2所示，其中主要的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)如圖2所示.這一結(jié)果與我們以往對(duì)不同來(lái)源的紫草的成分分析結(jié)果［23］具有相似性.

新疆紫草乙醇提取物含有近50%的異戊酸、2－甲基丁酸和3－甲基巴豆酸.這類(lèi)異戊烯類(lèi)結(jié)構(gòu)單元也出現(xiàn)在紫草特征性成分紫草萘醌化合物的烷基側(cè)鏈中；相對(duì)含量較高（合計(jì)超過(guò)10%）的二十一烷（7.06%）和十七烷醇（5.04%）等長(zhǎng)烷脂肪族化合物也出現(xiàn)在新疆紫草乙醇提取物中.從紫草的GC－MS可以看出，這種中藥植物的生源代謝以乙酸－丙二酸及聚酮代謝途徑為主.

圖1 紫草乙醇提取物的總離子流圖譜Fig.1 The total ion chromatogram of the ethanol extract fromA.euchroma

表2 新疆紫草乙醇提取物成分分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of chemical constituent inthe ethanol extract fromA.euchroma

圖2 新疆紫草乙醇提取物GC－MS檢測(cè)到的主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of major compositions detected in the ethanol extract fromArnebia euchroma

新疆紫草95%乙醇提取物對(duì)耐藥金黃葡萄球菌具有顯著抑制作用，作為抗菌藥物用途，紫草的乙醇提取物具有最強(qiáng)的抑菌效果.不同極性溶劑提取物中，僅石油醚部位具有較好的抗耐藥菌活性，表明紫草抗菌活性物質(zhì)為提取物中的低極性組分.根據(jù)上述樣品的薄層色譜，發(fā)現(xiàn)活性組分AEC01的主要成分為紫草中特征性萘醌類(lèi)衍生物，因此，我們推斷萘醌類(lèi)成分為紫草這一中藥的抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)，這一實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行之中.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫草提取物抗菌活性并沒(méi)有隨著低極性物質(zhì)在石油醚組分中的含量增加而增強(qiáng)，甚至有所降低.因此，我們推測(cè)可能存在一些大極性物質(zhì)對(duì)低極性抗菌物質(zhì)具有某種程度的協(xié)同增效作用，將在進(jìn)一步的研究中分離紫草低極性和高極性萘醌類(lèi)特征成分，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證.

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