人類(lèi)干細(xì)胞線粒體外膜蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

羅天龍，鐘 揚(yáng)

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)由雙層高度特化的單位膜包被的重要細(xì)胞器，主要功能是通過(guò)氧化磷酸化作用合成三磷酸腺苷（ATP），為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供能量.近幾年研究發(fā)現(xiàn)線粒體還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，從而調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)［1－3］.線粒體功能異常不僅在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，而且在衰老過(guò)程中的核心作用已被生物醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)同［4－5］.目前多能干細(xì)胞或iPSC技術(shù)應(yīng)用于線粒體相關(guān)疾病的機(jī)制研究，證實(shí)線粒體與多能干細(xì)胞的干性維持、分化及體細(xì)胞重編程等有著密切關(guān)系［6－7］.

而線粒體的某些功能只有在特定的組織細(xì)胞中才能展現(xiàn).細(xì)胞吞噬新機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞上的線粒體膜蛋白UCP2能降低線粒體膜電位，調(diào)控吞噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力，保持吞噬細(xì)胞自身平衡［8］.因此，了解人類(lèi)干細(xì)胞中線粒體蛋白的功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于我們深入認(rèn)識(shí)調(diào)控和改善線粒體功能以及修復(fù)損傷的線粒體對(duì)于衰老疾病預(yù)防和治療的重要作用.

人類(lèi)線粒體蛋白由核基因和線粒體基因共同編碼，包含大約1 500多種蛋白質(zhì)，現(xiàn)階段已建立了資源豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括MitoMiner（http：∥mitominer.mrc－mbu.cam.ac.uk），UniProt（http：∥www.uniprot.org／）、MitoCarta（http：∥www.broadinstitute.org／）、MitoP2（http：∥www.mitop.de）等.其中MitoMiner收錄了經(jīng)過(guò)質(zhì)譜研究和綠色熒光蛋白定位等已公布的線粒體蛋白，還整合了UniProt及MitoCarta中人類(lèi)和小鼠的資源.這些蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用參與相同或相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng).如PINK1的轉(zhuǎn)運(yùn)需要借助線粒體外膜受體蛋白Tom20和轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白Tom40，此過(guò)程受阻能夠?qū)е略绨l(fā)的青少年帕金森氏?。?］.而外膜蛋白VDAC1與線粒體內(nèi)膜蛋白ANT1組成四聚體調(diào)控線粒體膜電位，在黑色素瘤細(xì)胞的自噬性死亡和轉(zhuǎn)移中具有重要作用［10］.神經(jīng)精神疾病研究表明線粒體外膜蛋白Miro1介導(dǎo)BDNF共同調(diào)節(jié)線粒體的運(yùn)輸和分布［11］.盡管許多線粒體外膜蛋白的功能已經(jīng)闡明，但目前對(duì)于由線粒體外膜蛋白導(dǎo)致的疾病之間是否存在內(nèi)在的聯(lián)系還不是很清楚，尤其尚不清楚外膜蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系.

線粒體外膜蛋白僅占線粒體蛋白總量的約1%，但通過(guò)蛋白質(zhì)的相互作用參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程，影響或決定相關(guān)細(xì)胞活動(dòng).建立蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，已成為認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)功能和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［12－13］.Pagliarini等于2008年報(bào)道了哺乳動(dòng)物線粒體蛋白質(zhì)組和線粒體疾病的系統(tǒng)鑒定結(jié)果，其中分析了14種小鼠組織的線粒體蛋白質(zhì)組［14］.線粒體膜蛋白參與多種生化反應(yīng)，與線粒體膜間隙蛋白相互作用，調(diào)節(jié)膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等［15－16］.線粒體外膜蛋白質(zhì)間存在著眾多調(diào)控關(guān)系，對(duì)其相互作用的研究對(duì)于解釋線粒體外膜蛋白質(zhì)的功能和作用機(jī)制具有重要意義.本研究旨在通過(guò)整合公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源，建立一個(gè)線粒體外膜蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，從中挖掘有用的信息，注釋差異基因／蛋白相互作用關(guān)系圖，解釋這些蛋白與生物學(xué)功能相關(guān)聯(lián)的途徑，為后續(xù)生物學(xué)意義的深度挖掘提供支持.

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 線粒體外膜蛋白數(shù)據(jù)的收集

選擇權(quán)威谷歌（Google）搜索引擎點(diǎn)擊率測(cè)試排名前10位的線粒體蛋白公共數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)涉及的物種以及更新時(shí)間進(jìn)行考察與篩選，確定具備更新速度快、數(shù)據(jù)量豐富和蛋白同源分析功能等特征的數(shù)據(jù)庫(kù)，分別為MitoMiner、SwissProt和MitoP2.以這三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行線粒體外膜蛋白篩選.經(jīng)條件過(guò)濾，選擇具有文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)支持的蛋白數(shù)據(jù)，分別獲得98、87和45個(gè)注釋為定位于線粒體外膜上的蛋白.合并三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的線粒體外膜蛋白，并去除冗余數(shù)據(jù).

1.2 線粒體外膜蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／geo獲取人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE22499［17］.該數(shù)據(jù)集包含15個(gè)人類(lèi)干細(xì)胞不同條件下的基因轉(zhuǎn)錄變化數(shù)據(jù).表達(dá)譜數(shù)據(jù)的處理采用R－project解析，需要用到擴(kuò)展包Affy和hgu133plus2hsrefseqcdf等（http：∥www.r－project.org）.轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因繼續(xù)放入U(xiǎn)niProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.uniprot.org）中驗(yàn)證測(cè)試，獲得干細(xì)胞及干細(xì)胞線粒體的真實(shí)有效表達(dá)蛋白數(shù)據(jù).

從BioGRID網(wǎng)站（http：∥thebiogrid.org）下載人類(lèi)蛋白質(zhì)的PPI數(shù)據(jù).在BioGRID首頁(yè)進(jìn)入downloads頁(yè)面，選擇BIOGRID－organism，即按物種分類(lèi)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行下載.打開(kāi)壓縮包，從中找到人類(lèi)的相關(guān)數(shù)據(jù)文件BIOGRID－organism－Homo＿sapiens.zip并解壓，得到全部人類(lèi)蛋白相互作用數(shù)據(jù).

基于BioGRID 的人類(lèi)蛋白質(zhì)PPI數(shù)據(jù)，獲得干細(xì)胞及線粒體中有效表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的PPI數(shù)據(jù).PPI網(wǎng)絡(luò)的圖形繪制應(yīng)用Cytoscape軟件（http：∥www.cytoscape.org）實(shí)現(xiàn).

1.3 GO 和KEGG分析

選擇網(wǎng)站W(wǎng)ebGestalt（http：∥bioinfo.vanderbilt.edu／webgestalt／）提供的GO（Gene Ontology）層次聚類(lèi)方法，對(duì)線粒體外膜蛋白及互作蛋白進(jìn)行功能分類(lèi)，及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集方法，鑒別具有顯著意義的富集通路［18］.兩種分析分別選擇hypergeometric測(cè)試，統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性P 值取小于0.001.

2 結(jié)果

2.1 線粒體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇和比較

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了許多資源豐富的在線線粒體基因及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù).經(jīng)過(guò)權(quán)威谷歌（Google）檢索引擎的點(diǎn)擊率測(cè)試，檢索到排名前10 位的線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，分別是MitoMiner、SwissProt、MitoP2、LOCATE、MitoCarta、HMPDb、AMPDb、YMP、Mitoproteome、MTDb（表1）.其中點(diǎn)擊量最高的是MitoMiner，它較全面地收錄了已公布了的質(zhì)譜研究結(jié)果以及綠色熒光蛋白定位鑒定的線粒體蛋白，包含來(lái)自人類(lèi)的321種和小鼠的166種線粒體亞細(xì)胞定位的蛋白；并且整合了PubMed、UniProt、GO、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）、KEGG的資源.這10個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的線粒體蛋白信息，涉及的物種包含人類(lèi)、小鼠、果蠅、酵母、脈孢菌、擬南芥、瘧原蟲(chóng)、牛、四膜蟲(chóng)等.目前涉及物種最全的是MitoMiner和SwissProt，而收集人和鼠的線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)量較多.YMP數(shù)據(jù)庫(kù)是法國(guó)人較早研究酵母線粒體蛋白而建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，近幾年沒(méi)有更新（表1）.AMPDb則是由澳大利亞人建立的擬南芥線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，包括實(shí)驗(yàn)和軟件預(yù)測(cè)兩部分?jǐn)?shù)據(jù).SwissProt現(xiàn)在已經(jīng)被UniProt整合收并，這也使得數(shù)據(jù)量更豐富，另外，MitoP2雖然不如MitoMiner和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)秀，但是它具有蛋白質(zhì)同源分析、線粒體蛋白質(zhì)定位等功能.

通過(guò)對(duì)涉及物種以及更新時(shí)間進(jìn)行考察與篩選（表1），確定具備更新速度快、數(shù)據(jù)量豐富和蛋白質(zhì)同源分析功能等特征的數(shù)據(jù)庫(kù)，分別為MitoMiner、SwissProt和MitoP2，以此作為線粒體外膜蛋白數(shù)據(jù)挖掘的基礎(chǔ).

表1 點(diǎn)擊率最高的10個(gè)線粒體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及涵蓋的物種范圍Tab.1 The top 10mitochondrial protein database and the species range covers

2.2 線粒體外膜蛋白的篩選和注釋信息整理

初步篩選MitoMiner、SwissProt和MitoP2數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)條件過(guò)濾，選擇具有文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)支持的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù).MitoMiner數(shù)據(jù)庫(kù)中存在178個(gè)線粒體蛋白，進(jìn)一步手動(dòng)篩選找到107個(gè)有數(shù)據(jù)支持的線粒體外膜蛋白.SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)比較人性化，從搜索引擎中直接找到84個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的線粒體外膜蛋白.MitoP2數(shù)據(jù)庫(kù)中存在935個(gè)線粒體蛋白，進(jìn)一步手動(dòng)篩選亞細(xì)胞定位注釋?zhuān)@得45個(gè)線粒體外膜蛋白.3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得107、84和45個(gè)注釋定位于線粒體外膜上的蛋白質(zhì).去除冗余數(shù)據(jù)后，共得到92個(gè)具有文獻(xiàn)支持的明確定位于線粒體外膜的蛋白（表2）.

表2 數(shù)據(jù)庫(kù)中具有文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)支持的線粒體外膜蛋白Tab.2 The mitochondrial outer membrane proteins which have literature and experimental support in the database

2.3 線粒體外膜蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了獲得人類(lèi)細(xì)胞中與線粒體外膜蛋白可以產(chǎn)生相互作用的蛋白，選擇人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GEO number：GSE22499），分析結(jié)果顯示，在干細(xì)胞及線粒體中表達(dá)的基因?yàn)?5 252個(gè).該數(shù)據(jù)集包含15個(gè)人類(lèi)干細(xì)胞不同條件下真實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，于UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證測(cè)試后獲得18 710個(gè)蛋白，最后至人類(lèi)蛋白質(zhì)的PPI數(shù)據(jù)庫(kù)BioGRID 中發(fā)現(xiàn)14 349條數(shù)據(jù).基于BioGRID查詢(xún)結(jié)果和篩選獲得的線粒體外膜蛋白數(shù)據(jù)，確定出干細(xì)胞及干細(xì)胞線粒體內(nèi)與線粒體外膜蛋白具有相互作用的真實(shí)有效PPI關(guān)系數(shù)據(jù)為3 055個(gè).

PPI關(guān)系數(shù)據(jù)細(xì)分以后，發(fā)現(xiàn)目前在BioGRID 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的線粒體外膜蛋白90個(gè)，而與這些蛋白具有直接關(guān)系的蛋白數(shù)量為1 170個(gè).與線粒體外膜蛋白相關(guān)的PPI關(guān)系數(shù)據(jù)中去除冗余數(shù)據(jù)等，獲得1 889條蛋白互作數(shù)據(jù).為了直觀地展示線粒體外膜蛋白與其他蛋白之間的相互作用關(guān)系，利用Cytoscape構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）.

圖1 Cytoscape分析繪制的煙花狀PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The PPI network diagram analysis and drawing by the Cytoscape

連接數(shù)前三位蛋白分別是ATF2，DDX3X 和BCL2，鏈接數(shù)分別是191，123和90.而PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中hub節(jié)點(diǎn)（無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)中小部分具有較多連接的節(jié)點(diǎn)）的結(jié)構(gòu)重要性與其功能重要性之間存在著相關(guān)性.圖1展現(xiàn)出鏈接數(shù)最大的節(jié)點(diǎn)為ATF2（鏈接數(shù)191），其次兩個(gè)蛋白為DDX3X 和BCL2（鏈接數(shù)分別為123和90）.線粒體外膜蛋白的鏈接數(shù)目大于50的有11個(gè)，而鏈接數(shù)目大于10的外膜蛋白數(shù)目有46個(gè)，占一半以上.蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有密集鏈接的hub節(jié)點(diǎn)蛋白，其節(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)重要性與其功能重要性之間存在著相關(guān)性［19］.此網(wǎng)絡(luò)中ATF2已被報(bào)道與多種癌癥有關(guān)，還與神經(jīng)系統(tǒng)方面的腫瘤相關(guān)［20］.

2.4 GO 和KEGG pathway分析結(jié)果

為了證實(shí)與線粒體外膜蛋白的互作蛋白，具有功能重要性和通路富集，采用WebGestalt網(wǎng)站提供的分析工具，進(jìn)行GO 功能分類(lèi)和KEGG 通路富集.1 260個(gè)蛋白的GO 生物途徑分類(lèi)結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞凋亡（GO：0016265）和細(xì)胞代謝過(guò)程（GO：0044237）遠(yuǎn)高于其他類(lèi)別.另一方面，KEGG 富集通路結(jié)果，表明癌癥等疾病和凋亡通路位于前10位.這說(shuō)明線粒體外膜蛋白的作用，是細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡所需的基礎(chǔ)代謝，其功能異常將會(huì)容易導(dǎo)致腫瘤及癌癥的發(fā)生.

3 討論

線粒體在真核細(xì)胞中參與多種重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，與腫瘤和癌癥等疾病密切相關(guān)，而線粒體蛋白質(zhì)跨線粒體內(nèi)外膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)是維持線粒體功能的重要環(huán)節(jié).本研究旨在建立線粒體外膜蛋白與細(xì)胞中其他蛋白相互作用的子網(wǎng)絡(luò)，為研究者提供一種整合數(shù)據(jù)形成PPI網(wǎng)絡(luò)及分析網(wǎng)絡(luò)模體或通路的方法.

圖2 通過(guò)WebGestalt獲得的GO 分類(lèi)，線粒體外膜蛋白的互作蛋白富集于細(xì)胞凋亡（GO：0016265）和細(xì)胞代謝過(guò)程（GO：0044237）Fig.2 GO classification obtained by WebGestalt，mitochondrial outer membrane protein interaction protein enriched in apoptosis（GO：0016265）and cell metabolic processes（GO：0044237）

線粒體外膜蛋白的表達(dá)具有組織及細(xì)胞種類(lèi)的特異性，本研究不僅整合了MitoMiner、SwissProt和MitoP2等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取線粒體外膜蛋白數(shù)據(jù)，而且還收集了15個(gè)人類(lèi)干細(xì)胞不同條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集.另外，還需應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘等一系列生物信息學(xué)方法，篩選及去冗余等，方可獲得具有文獻(xiàn)支持的高可信度的線粒體外膜蛋白清單.而由人類(lèi)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，可有效降低其他特定組織細(xì)胞中表達(dá)蛋白的影響，進(jìn)而獲得干細(xì)胞內(nèi)真實(shí)有效的與線粒體外膜蛋白具有相互作用的完整蛋白集合.于BioGRID數(shù)據(jù)庫(kù)中找出對(duì)應(yīng)PPI關(guān)系數(shù)據(jù)，Cytoscape進(jìn)行作圖，初步繪制出直觀的PPI網(wǎng)絡(luò)圖.

如何從PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別出跟線粒體外膜蛋白功能相關(guān)的模體或通路，是研究生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵一步.hub節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在生物學(xué)上具有顯著意義，在本研究結(jié)果中的線粒體外膜蛋白與其他蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)中（圖1），ATF2是其中鏈接數(shù)最多的蛋白（鏈接數(shù)191），其次兩個(gè)蛋白為DDX3X 和BCL2（鏈接數(shù)分別為123和90）.它們參與多種生物學(xué)過(guò)程，例如轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸、凋亡、癌癥腫瘤等.另一方面，PPI網(wǎng)絡(luò)成員的功能分類(lèi)及通路富集有助于此網(wǎng)絡(luò)主要功能的理解.線粒體外膜蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)參與蛋白的GO 和KEGG 結(jié)果均表明，細(xì)胞凋亡和代謝途徑為其富集功能，這為我們認(rèn)識(shí)和理解線粒體外膜蛋白在癌癥等疾病中的作用提供了幫助.

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