東海裸五角瓜參膠原蛋白提取及其性質(zhì)研究

周光東，鄧尚貴，俞曉雯，蔡林林

（浙江海洋學院 浙江舟山316000）

東海裸五角瓜參膠原蛋白提取及其性質(zhì)研究

周光東，鄧尚貴*，俞曉雯，蔡林林

（浙江海洋學院 浙江舟山316000）

本研究以舟山產(chǎn)裸五角瓜參為對象，研究了體壁組織的基本組成成分、酸溶與胃酶促溶膠原提取率、提取膠原蛋白特性以及其體外抗氧化性。結果表明：裸五角瓜參蛋白質(zhì)含量較高，粗蛋白含量達到18.56%，且以膠原蛋白為主，該膠原蛋白經(jīng)酸提法和酶提法處理后具有典型的水產(chǎn)品膠原蛋白特性，2%為NaCl最佳添加濃度；電泳實驗表明該膠原蛋白的鏈和β鏈分子量分別為98 kU和102 kU；此外，兩種膠原蛋白還具有一定的抗氧化性，但其抗氧化能力較弱。

裸五角瓜參（Pentacta inornata）；膠原蛋白；性質(zhì)

裸五角瓜參（Pentacta inornata）屬海參綱，光參科，廣泛分布于我國東南沿海各省，尤以浙江境內(nèi)產(chǎn)量最大，是一種常見的低值海參。長期以來，由于裸五角瓜參表皮堅硬，水發(fā)時間長，家庭條件難以烹調(diào)食用，造成這類豐富的海參資源長期得不到應有的開發(fā)利用，市場售價與經(jīng)濟價值背離［1］。盡管刺參肉質(zhì)細嫩，已經(jīng)成為海參消費市場的主流消費對象，但由于刺參的養(yǎng)殖規(guī)模目前已經(jīng)不能得到有效增長，而市場對海參的需求逐年擴大，形成了光參得不到充分利用，而刺參又不能滿足市場對海參的旺盛需求的局面。因此，深入研究光參基本特性，為其充分開發(fā)利用奠定基礎成為這類資源實現(xiàn)高效利用的必然途徑。本研究以此為背景，以舟山產(chǎn)裸五角瓜參為研究對象，研究其體壁組織的基本組成成分，酸溶與胃酶促溶膠原提取率、提取膠原蛋白特性以及其體外抗氧化性，以期為光參的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

裸五角瓜參，捕撈于舟山嵊泗海域，購于舟山國際水產(chǎn)城碼頭，要求原料鮮活。原料收購后立刻裝入碎冰泡沫箱，1 h內(nèi)運至實驗室，保存于-55℃超低溫冰箱，備用；原料經(jīng)浙江海洋學院海洋科學學院趙盛龍教授鑒定為裸五角瓜參（Acaudina Molpadioides）；原料所需化學試劑、酶制劑及分子量標準品等均購于國藥集團上海化學試劑有限公司，均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（A-1000S）：日本東京理化；LGJ-10B冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠；HZQ-F160A其恒溫震蕩培養(yǎng)箱：北京四環(huán)科學儀器廠；JZQ-Ⅱ均質(zhì)器：天津東康科技有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計：日本日立有限公司；其余均為實驗室常用設備。

1.2 方法

1.2.1 預處理

原料從冰箱中取出后，流水解凍，剖腹，去除內(nèi)臟，瀝干，待用。

1.2.2 基本營養(yǎng)成分測定

水分、灰分、蛋白質(zhì)、粗脂肪等常規(guī)營養(yǎng)成分測定參照國標法，膠原蛋白含量測定參照Visessanguan等方法［2］。

1.2.3 膠原蛋白酸性提取

膠原蛋白酸提法參考朱偉的方法［3］，具體操作為：將光參體壁剪碎，用0.1 mol/L的NaOH浸泡8 h，清洗至中性，再加入0.5 mol/L的乙酸溶液浸泡24 h，浸泡完畢后過濾、離心，除去不溶物；取上清液，緩慢加入一定量的固體NaCl，4℃下靜置過夜后可見有白色絮狀沉淀析出，即為膠原蛋白；上清液高速離心（10 000 r/min，30分鐘）后得到酸溶性膠原蛋白，1 000D分子量透析膜清水中透析至中性后冷凍干燥，備用。

1.2.4 膠原蛋白酶解提取

酶法提取在參考劉成梅等方法基礎上改用胃蛋白酶［4］。將酸提法中得到的不溶物收集后，按照酶=不溶物質(zhì)質(zhì)量比1∶1 000比例加入蛋白酶（酶活力30 000 U/g），而后加入不溶物總質(zhì)量10倍的、pH為2的乙酸溶液，37℃保溫2 h后100℃滅酶10 min，過濾，取濾液加入一定量的NaCl，剩余操作同酸提法。其中膠原蛋白溶出率/%=（獲得的膠原蛋白/總膠原蛋白）*100，其中獲得的膠原蛋白量為酸法提取和酶法提取量總和。

1.2.5 光參膠原蛋白紫外吸收光譜分析

精確稱取10 mg光參膠原蛋白溶解于10 mL濃度為0.5 mol/L乙酸溶液中，于190 nm～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，采用0.5 mol/L乙酸溶液為空白。

1.2.6 光參膠原蛋白電泳分析

精確稱取膠原蛋白1 mg，溶解于0.5 mol/L乙酸溶液中，用0.01 mol/LNaOH調(diào)節(jié)至中性后加入緩沖液后置于沸水浴5 min，取出后8 000 r/min離心5 min，取適量上清液進行電泳，電泳條件為直流穩(wěn)壓電源，電流為15 mA，時間2 h～3 h；分離膠條件為：濃度20%分離膠：30%凝膠儲備液3 mL，3 mol/L pH8.9的Tris-HCl緩沖液3 mL，10%SDS 0.1 mL，10%過硫酸銨0.1 mL， TEMED 0.006 mL，再加入重蒸水0.6 mL；濃度5%濃縮膠：30%凝膠儲備液0.83 mL，0.5 mol/L，pH6.7的Tris-HCl緩沖液0.63 mL，10%SDS 0.5 mL，10%過硫酸銨0.05 mL，TEMED 0.005 mL，再加入重蒸水3.4 mL；電極緩沖液：Tris-甘氨酸緩沖液，pH8.3；樣品緩沖液：0.02 mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，內(nèi)含1%SDS，0.02%溴酚藍，20%甘油，1%巰基乙醇；染色液：0.25 g考馬斯亮藍R-250加入91 mL 50%甲醇，9 mL冰醋酸配制而成；脫色液：75 mL冰醋酸，875 mL重蒸水和50 mL甲醇混勻。

樣品分子量從標準蛋白遷移率同其分子量對數(shù)標準曲線上計算獲得。遷移率按下式計算：

遷移率Rf=樣品移動距離（mm）/溴酚藍移動距離（mm）

1.2.7 光參膠原蛋白抗氧化能力測定

光參膠原蛋白抗氧化能力測定采用DHHP法［5］，并參考Kumar等方法［6］，采用鐵氰化鉀法測定其還原能力?？寡趸芰y定中以等劑量VC做對照。

2 結果與分析

2.1 裸五角瓜參基本營養(yǎng)成分

裸五角瓜參基本營養(yǎng)成分見表1。

表1 裸五角瓜參基本營養(yǎng)成分Table 1 Bascial nutrition consitituation of sea cucumber %

表1為裸五角瓜參基本營養(yǎng)成分數(shù)據(jù)。從表中可以看出，瓜參水含量較高，同東風螺、牡蠣、管角螺等貝類水分含量接近［7］，而灰分含量較高，表明含有較為豐富的礦物元素，這可能是由瓜參生活海域所致。從表1還可以看出，裸五角瓜參中碳水化合物主要為多糖類物質(zhì)，這也表明裸五角瓜參可能還有較多的生理活性物質(zhì)。裸五角瓜參粗脂肪含量較低，而蛋白質(zhì)含量較高，由此可見，裸五角瓜參是一類符合現(xiàn)代消費人群對食品中低脂要求的良好的蛋白質(zhì)補充來源。

2.2 裸五角瓜參膠原蛋白紫外光譜分析

圖1是裸五角瓜參酸溶膠原蛋白和胃蛋白酶溶膠原蛋白紫外吸收光譜圖。

圖1 裸五角瓜參酸溶膠原與胃酶促溶膠原紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of collagen of sea cucumber

通常由于蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸、脯氨酸和組氨酸都含有共軛雙鍵，使得大多數(shù)蛋白質(zhì)在280 nm處都有一個很強的紫外吸收，而在圖1中的280 nm處并未出現(xiàn)吸收峰，表明該蛋白并非普通蛋白；由于膠原蛋白本身含有酪氨酸和苯丙氨酸，而這兩種氨基酸具有敏感的發(fā)色團，對300 nm以下波長存在最大吸收，從圖中可以看出，2種不同提取方式的膠原蛋白溶液在230 nm處均有最大吸收波峰，完全符合膠原蛋白的紫外吸收特性此外，在230 nm處出現(xiàn)最大吸收峰也可能是由于裸五角瓜參膠原蛋白的多肽鏈中含有C= O雙鍵較多的氨基酸導致，其中天冬氨酸、精氨酸等都含有C=O雙鍵。

2.3 加入的NaCl對膠原蛋白溶出的影響

圖2是膠原蛋白上清液中加入不同濃度NaCl對膠原蛋白溶出率的影響。

圖2 不同濃度NaCl對膠原蛋白溶出的影響Fig.2 Effect of different concentration of NaCl on dissolution rate of collogen

從圖2中可以看出，兩種提取方式所獲得的膠原蛋白的溶出率同NaCl加入量呈負相關，NaCl加入越多，溶出率越低。其中酸提法NaCl濃度為1%和2%時膠原蛋白溶出率分別為98.87%和98.23%，而酶提法同濃度NaCl的溶出率分別為98.67%和98.12%，基本沒有差別，而當NaCl加入量提高到3%時，膠原蛋白溶出率降低到80.23%和81.28%，因此確定兩種提取方法中NaCl最佳用量為1%～2%。試驗中發(fā)現(xiàn)，盡管1%的NaCl濃度的膠原蛋白溶出率最高，但當NaCl濃度為2%時有利于胃蛋白酶活力的穩(wěn)定。因此確定2%為最佳NaCl添加濃度。

2.4 光參膠原蛋白電泳圖譜

圖3是裸五角瓜參膠原蛋白的電泳圖譜。

圖3 光參膠原蛋白電泳圖譜Fig.3 Gel electrophoresis of sea cucumber collogen

從圖3中可以看出，酶法和酸法提取的膠原蛋白分子量基本相同，其中酸法和酶法提取蛋白各獲得3條較為清晰的電泳帶，其中膠原蛋白的鏈分子量約為100 kU，而由于β鏈為α鏈的二聚體，則分子量約為200 kU，而γ鏈為α鏈的三聚體，理論上分子量約為300 kU。通過Maker遷移率可計算得到α鏈和β鏈分子量98 kU和102 kU，滿足典型水產(chǎn)品膠原蛋白特性，但試驗中并未發(fā)現(xiàn)γ鏈的泳帶，這可能和分離膠濃度及電泳條件有關。此外，從圖中還可以看出，除較為明顯的α鏈和β鏈的泳帶之外，還有若干條不太清晰的泳帶，這可能與膠原蛋白含有部分蛋白雜質(zhì)有關，表明酸提法和酶提法盡管具有較好的提取效果，但提取的膠原蛋白純度仍需進一步提高。

2.5 裸五角瓜參膠原蛋白抗氧化特性

圖4和圖5分別是不同提取方式的膠原蛋白對DPPH自由基清除率和還原能力結果。

圖4 不同濃度膠原蛋白對DPPH自由基的清除率Fig.4 Clearance of concentration of collogen on DPPH

圖5 不同濃度膠原蛋白的還原能力Fig.5 Reducing capacity of concentration of collogen

從圖4可以看出，2種提取方法得到的膠原蛋白在低濃度下（低于1.5%）對DPPH自由基的清除能力均顯著低于VC；隨著膠原蛋白濃度的提高，清除率也僅能達到等劑量VC的72%左右；從圖5可以看出，膠原蛋白的還原能力較弱，最高濃度（2.5%）的膠原蛋白還原能力僅為VC的33.4%左右。此外，從圖4和圖5中可知，提取方式對兩種膠原蛋白的抗氧化能力并沒有太大影響，酸提法和酶提法得到的膠原蛋白抗氧化能力之間并沒有顯著差別。通常，抗氧化能力和還原力之間存在關聯(lián)性，即一般來說還原能力越高，則抗氧化能力越強［8-9］。對于本試驗提取的膠原蛋白而言，其抗氧化性表現(xiàn)出一定的不對稱性，即膠原蛋白對DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除能力，但其還原性則較弱，其中原因有待進一步研究。

3 結論

裸五角瓜參蛋白質(zhì)含量較高，粗蛋白含量達到18.56%，其中主要以膠原蛋白為主；紫外光譜分析結果也表明通過酸提法和酶提法獲得的蛋白具有典型的膠原蛋白特性，在230 nm處具有典型的吸收峰；在酸提法和酶提法的基礎上，改用加入固體NaCl以提高膠原蛋白提取率，結果表明，2%的NaCl膠原蛋白溶出率最高；電泳圖譜表明所得的膠原蛋白具有典型的α鏈和β鏈，其分子量分別為98 kU和102 kU，但未分離得到γ鏈；抗氧化能力試驗結果表明，兩種膠原蛋白都具有一定抗氧化性，但抗氧化能力顯著低于VC，且表現(xiàn)出一定的不對稱性。

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Extraction and Characterization Investigation of Collagen from Sea Cucumber（Pentacta inornata）

ZHOU Guang-dong，DENG Shang-gui*，YU Xiao-wen，CAI Lin-lin
（College of Food and medcicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，Zhejiang，China）

This paper investigated the components of squid skin，the type and characteristics of the collagen from sea cucumber（Pentacta inornata）.The results were as follows：content of crude protein was 16.43%，which was mainly collagen.The protein extracted from sea cucumber was typically the aquatic collagen after been tested by UV scanning.Concentration of 2%could get the highest dissolution rate.The electrophoresis classified collagen into two parties，and β，respectively，and which possessed molecular weight 98 kU and 102 kU.Furthmore，these two kinds of collagen had a certain antioxidative ability，but which was comparatively low compared to VC.

Pentacta inornata；collagen；character

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.012

2014-11-11

“十二五”國家科技支撐計劃“水產(chǎn)品加工過程質(zhì)量安全控制關鍵技術集成與示范”（2012BAD29B06）

周光東（1994—），男（漢），本科生，目前就讀于浙江海洋學院食品科學與工程專業(yè)。

*通信作者：鄧尚貴（1966—），男（漢），教授，博導，博士，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏。