乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)T細胞克隆性分析

張建波 呂曉東 楚廣民 宋魏 馮穩(wěn) 劉明閣 于慶凱

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科 河南 鄭州 450003;2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 中心實驗室 河南 鄭州 450003)

T 細胞在機體抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用，它以識別腫瘤相關(guān)抗原的T 細胞克隆性增生為特點［1］。研究證明多種實體瘤患者體內(nèi)存在針對腫瘤抗原特異反應(yīng)的T 細胞克隆，分析這些克隆性增生的T 細胞，對于了解機體抗腫瘤的免疫狀態(tài)以及開展特異性免疫治療有重要意義［2］。本研究旨在利用免疫掃描譜型技術(shù)檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中T 細胞的克隆性增生情況，分析TCR BV 亞家族選擇性取用特點，為進一步的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標本 選取河南省腫瘤醫(yī)院確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(組織學(xué)Ⅱ級)住院患者10 例，均為女性，年齡28 ～73 歲，經(jīng)術(shù)中快速冰凍檢查明確腋窩前哨淋巴結(jié)有癌微轉(zhuǎn)移標本。同時取2 例反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標本作為對照。

1.2 主要試劑 Trizol reageant、SuperScript ⅢReverse Transcriptase、LD PCR PrimerⅡA 購自美國Invitrogen公司，Advantage 2 Polymerase Mix 購自美國BD Biosciences Clontech 公司，TaqDNA 聚合酶購自美國Promega公司，膠純化試劑盒購自美國Omega biotek 公司。

1.3 RNA 提取及cDNA 合成 將癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)周圍的淋巴組織及對照組淋巴結(jié)標本在200 目篩網(wǎng)上進行研磨后用PBS 進行沖洗，收集細胞懸液并計數(shù)，提取總RNA 合成20 μl cDNA。

1.4 PCR 擴增24 個TCR BV 亞家族 根據(jù)文獻設(shè)計并合成24 個TCR BV 亞家族上游引物及共用的FAM 標記下游引物和對照引物［3］，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成?？偡磻?yīng)體系50 μl，其中cDNA模板1 μl，dNTP 5 μl，10 ×buffer 5 μl，25 mmol/L 氯化鎂3 μl，上游引物1.8 μl，共用FAM 標記的下游引物1.8 μl，Taq DNA 聚合酶1.25 U。反應(yīng)條件為:預(yù)變性94 ℃3 min;94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。取PCR 產(chǎn)物7 μl 在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.5 利用GeneScan 技術(shù)分析TCR BV 家族的優(yōu)勢取用 取5 μl 熒光引物擴增的TCR BV 各亞家族PCR產(chǎn)物與3μl DNA 變性膠上樣緩沖液混合，從中取出2 μl加入0.5 μl 標準品。94 ℃變性4 min 后上樣至6%聚丙烯酰胺凝膠，373 DNA 序列分析儀中電泳分析結(jié)果，用GeneScan 672 軟件基因掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 T 細胞TCR BV 亞家族RT－PCR 結(jié)果 10 例乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)與反應(yīng)性增生淋巴結(jié)標本中全部24個TCR BV 亞家族均有擴增，擴增片段大小在150 ～350 bp(圖1、圖2)。由于同一亞家族其上游BV 引物、下游BC 引物在TCRβ 鏈中的位置是固定的，所以PCR 擴增產(chǎn)物大小取決于多樣區(qū)基因(BD)以及BV－BD、BD－BJ 基因之間(CDR3)隨機插入核苷酸的多少。

圖1 對照組1 的24 個TCR BV 亞家族PCR 擴增結(jié)果

圖2 病例1 的24 個TCR BV 亞家族PCR 擴增結(jié)果

圖3 對照組1 的24 個TCR BV 亞家族GeneScan 掃描圖

2.2 T 細胞中TCR CDR3 GeneScan 分析及TCR BV 亞家族的表達 2 例反應(yīng)性增淋巴結(jié)24 個BV 亞家族均有表達，基因掃描呈多個峰的譜型，即Gaussian分布，提示為多克隆(圖3)。10 例乳腺癌患者檢測結(jié)果顯示大部分BV 亞家族呈現(xiàn)與反應(yīng)性淋巴結(jié)相似的多峰圖像，少部分家族呈單一主峰，提示PCR產(chǎn)物為CDR3 長度完全相同的T 細胞，也就是單克隆細胞;還有少部分為單一主峰伴個別極低的小峰，提示產(chǎn)物主要來自同一克隆也就是寡克隆性;也有個別為多克隆逐漸向寡克隆形式發(fā)展，稱為寡克隆增生趨勢，各病例24 個BV 亞家族的表達和克隆性結(jié)果見表1。圖4為病例1 的24 個TCR BV 亞家族CDR3 的基因掃描譜型圖，其中BV2 呈單一主峰，BV7、BV23 呈單一主峰和少數(shù)小峰圖像，即寡克隆，其余BV 亞家族基本為多峰圖像。

圖4 病例1 的24 個TCR BV 亞家族GeneScan 掃描圖

表1 10 例乳腺癌24 個TCR BV 亞家族表達和T 細胞克隆性特點

3 討論

T 細胞通過TCR 識別抗原，由于TCR 的β 鏈由V－D－J－C 基因片斷重排后編碼，可構(gòu)成具有不同特異性的TCR 分子，由此決定T 細胞識別抗原的多樣性和特異性。TCR 重排過程中，V－D－J 的基因片段進行重排和隨機插入核甘酸(N 區(qū))形成一高度可變區(qū)，稱為互補決定區(qū)3(CDR3)［4］。通過對CDR3 長度和序列的分析，可作為判別T 細胞克隆性的指標。PCR－GeneScan(基因掃描)－序列分析方法［5］通過檢測CDR3 的長度是否相同以確定T 細胞的克隆性，然后對出現(xiàn)單克隆或寡克隆的PCR 產(chǎn)物進行序列分析，從而了解其CDR3 的核甘酸序列，是檢測T 細胞克隆性較為理想的方法。

利用該方法，本研究檢測了10 位乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的T 細胞克隆，結(jié)果顯示大部分病例均存在T 細胞的克隆性增生，增生形式有單克隆、寡克隆、寡克隆趨勢及譜型偏移，說明乳腺癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中存在針對乳腺癌相關(guān)抗原的T 細胞克隆性增生。T 細胞在乳腺癌相關(guān)抗原的持續(xù)刺激下，某一個或者某些與乳腺癌相關(guān)抗原有高親和力的T 細胞克隆得到優(yōu)勢表達并克隆性增生，通過分析這些T 細胞克隆，可以了解機體相應(yīng)的細胞免疫反應(yīng)［2］。本研究中1 例患者未發(fā)現(xiàn)T 細胞的克隆性表達，只是表現(xiàn)為譜型的偏移，類似的譜型偏移在其他病例也有不同程度的出現(xiàn)，可能與T 細胞對腫瘤相關(guān)抗原的反應(yīng)性克隆性增生處于一個動態(tài)反應(yīng)的過程有關(guān)［6］。各患者優(yōu)勢表達的T 細胞克隆亞家族不同，可能與乳腺癌腫瘤抗原的多樣性以及個體差異有關(guān)。如果對克隆性T 細胞PCR 擴增產(chǎn)物測序，分析其CDR3 氨基酸序列，能進一步了解選擇相同BV 亞家族的T 細胞克隆是否來自相同的T 細胞群。

總之，本研究通過分析乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)T 細胞的克隆性增生情況，為了解機體抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)提供了依據(jù)，也為尋找腫瘤抗原表位、個體化免疫治療打下了基礎(chǔ)。

［1］He X Y，Yang W M，Tang W T，et al.TRAV gene expression in PBMCs and TILs in patients with breast cancer analyzed by a DNA melting curve (FQ－PCR)technique for TCR α chain CDR3 spectratyping［J］.Neoplasma，2012，59(6):693－699.

［2］Sherwood A M，Emerson R O，Scherer D，et al.Tumor－infiltrating lymphocytes in colorectal tumors display a diversity of T cell receptor sequences that differ from the T cells in adjacent mucosal tissue［J］.Cancer Immunol Immunother，2013，62(9):1453－1461.

［3］姚新生，馬驪，溫茜，等.監(jiān)測TCR CDR3 漂移的免疫掃描譜型分析技術(shù)的建立與鑒定［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2006，26(6):571－573.

［4］Sainz－Perez A，Lim A，Lemercier B，et al.The T－cell receptor repertoire of tumor－infiltrating regulatory T lymphocytes is skewed toward public sequences［J］.Cancer Res，2012，72(14):3557－3569.

［5］Blohm J H，Blohm N，Hummel M，et al.Detection of clonal T－cell－receptor (TCR)Vbeta rearrangements in explanted dilated cardiomyopathy hearts by semi－nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］.Med Sci Monit Basic Res，2013，(19):111－117.

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