在線固相萃取—高效液相色譜法檢測食用油中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴

王春蕾+劉華良+馬永建+阮麗萍

摘 要 建立了植物油中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的在線固相萃取-高效液相色譜-紫外/熒光（online-SPE-HPLC-UV/FLD）檢測分析方法。食用油樣品經(jīng)異丙醇稀釋定容并過濾，固相萃取柱ChromSpher Pi （80 mm×3 mm）在線凈化，反相C18 PAH專用柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm）分離，異丙醇、乙腈和水為流動相，梯度洗脫，紫外（220 nm）和熒光檢測器檢測。結果表明，15+1種多環(huán)芳烴在相應的線性范圍內(nèi)峰面積與質量濃度之間線性良好（R2>0.99）；檢出限為0.03～12.23 μg/kg；3個水平加標回收率為65.3%～110.5%；相對標準偏差為0.1%～9.8%。

關鍵詞 在線固相萃??；多環(huán)芳烴；高效液相色譜；食用油

1 引 言

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是普遍存在的持久性環(huán)境污染物，有機物的不完全燃燒和熱分解、地質化學過程都可能產(chǎn)生PAHs[1，2]。部分PAHs具有致癌性和遺傳毒性，沒有致癌性的PAHs可以作為促癌劑，對人體健康造成嚴重危害[3]。 1979年美國環(huán)保署（EPA）列出了16種優(yōu)控PAHs，2008年歐盟食品安全局（EFSA）對食品中PAHs進行評估，列出了15+1種優(yōu)控PAHs（15+1 EU- priority PAHs），與EPA優(yōu)控PAHs有8種相同，包含更多毒性較大的重質PAHs，目前的檢測方法大多是針對EPA列出的16種PAHs，而對歐盟優(yōu)控PAHs報道較少。

由于PAHs的親脂性，在食用油生產(chǎn)、加工和運輸過程中可能因環(huán)境污染或者加工不當而被污染[4～6]。一些機構和組織也制定了相關的衛(wèi)生限值，GB2762—2012規(guī)定食用油中苯并（a）芘的含量≤10 μg/kg[7，8]，歐盟法規(guī)No 835/2011規(guī)定除了可可油和椰子油，其它油脂中苯并（a）芘≤2 μg/kg，4種PAHs（苯并（a）蒽、屈、苯并（b）熒蒽和苯并（a）芘）之和≤10 μg/kg[9，10]。PAHs提取方法主要有離線和在線兩大類，常用的離線方法有液液萃取（LLE）[10，11]、固相萃?。⊿PE）[12，13]、凝膠滲透色譜（GPC）[14]和供體受體復合色譜法（DACC）[15，16]等，這些方法大多有復雜的前處理過程，費時費力，消耗大量有機溶劑；也有研究建立了基于DACC的在線凈化方法[17，18]，但是并不能同時檢測歐盟優(yōu)控PAHs。

本研究建立了檢測食用油中15+1種歐盟優(yōu)控PAHs的在線分析方法，采用在線固相萃?。╫nline-SPE）凈化，高效液相色譜紫外/熒光檢測器（HPLC-UV/FLD）定量分析。online-SPE的原理是基于DACC，PAHs是π電子供體，與π電子受體的固定相結合而被保留在固定相中。這種在線分析方法可以減少有機溶劑的使用，大大縮短分析時間。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo公司），配有3400型紫外檢測器，3100型熒光檢測器；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（德國Sartorius公司）；分析天平（德國Sartorius公司）。

乙腈（ACN）、異丙醇（IPA）均為色譜純（德國默克股份兩合公司）；水為超純水；15

種歐盟優(yōu)控PAHs混合標準溶液（德國Dr. Ehrenstorfer公司）：環(huán)戊烯（c，d）芘（cyclopenta（c，d）pyrene，CPP）、苯并（a）蒽（Benzo（a）anthracene，BaA）、GFDA2（Chrysene，Chr）、5-甲基-1，2-苯并菲（5-methylchrysene，SMC）、苯并（b）熒蒽（Benzo（b）fluoranthene，BbF）、苯并（j）熒蒽（Benzo（j）fluoranthene，BjF）、苯并（k）熒蒽（Benzo（k）fluoranthene，BkF）、苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，BaP）、二苯并（a， h）蒽（Dibenzo（a，h）anthracene， DaA）、苯并（g，h，i）苝（Benzo（g，hi）perylene，BgP）、茚并（1，2，3-cd）芘（Indeno（1，2，3-cd）pyrene，IcP）、二苯并（a，e）芘（Dibenzo（a，e）pyrene，DeP）、二苯并（a，h）芘（Dibenzo（a，h）pyrene，DhP）、二苯并（a，i）芘（Dibenzo（a，i）pyrene，DiP）、二苯并（a，l）芘（Dibenzo（a，l）pyrene，DlP），苯并（c）芴（benzo（c）fluorene，BcF），每種物質為10 μg/mL的ACN溶液。

2.2 實驗方法

2.2.1 空白油樣制備

稱取約40 g食用油，加入5%活性炭，90℃旋轉蒸發(fā)2 h，離心后上層液過0.45 μm濾膜。 稱取食用油樣品4.0 g（精確至0.01 g）， 用IPA溶解并定容至5 mL，混勻過0.45 μm濾膜，待測。

2.2.2 色譜條件

在線固相萃取柱ChromSpher Pi（80 mm×3 mm，Thermo公司），分析柱C18 PAH專用柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司），柱溫30℃，進樣盤溫度40℃～45℃，根據(jù)油的性狀進行調整，進樣量40 μL，萃取柱用IPA、ACN和水梯度洗脫：0～5 min，100% IPA，流速為0.5 mL/min；5.2～7.0 min，60% ACN，流速為0.5 mL/min；8～29 min，流速為0；30～69 min，100% ACN，流速為0.5 mL/min； 70 min后回到初始狀態(tài)。分析柱用ACN和水梯度洗脫：0～5 min，60% ACN，流速為0.5 mL/min；6～30 min，60% ACN，流速為1.2 mL/min；30～48 min，60%～100% ACN，流速為1.2 mL/min；48～55 min，100% ACN，流速為1.2 mL/min；55～56 min，100% ACN，流速1.2～2.0 mL/min，維持至80 min； 80 min后回到初始狀態(tài)。0～7 min為萃取階段，7～30 min為轉移階段，30～88 min為分析平衡階段，分別在7和30 min處進行閥切換，具體切換通路見圖1。endprint

圖1 不同階段閥切換通路

Fig.1 Column switching mechanism in different periods

3 結果與討論

3.1 在線萃取條件優(yōu)化

在線萃取采用ChromSpher Pi柱，運用供體與受體結合的原理進行在線凈化，參考文獻[19]的方法，用IPA上樣。研究表明，用IPA上樣流速不宜過大。國外已有的在線凈化技術的上樣體積較大，通常大于100 μL，洗脫時間約為10～12 min， 運用2個六通閥進行切換，兩根色譜柱實現(xiàn)分離[18，19]，過程較為復雜。本研究采用小體積上樣，1個六通閥切換，1根色譜柱分離，可以縮短萃取時間，操作簡單。采用100% IPA上樣，去除油中大分子脂肪酸和色素物質，上樣結束后切換六通閥， 用ACN-H2O，去除多余的IPA，過渡到分析柱的洗脫條件。分析柱的初始濃度為60% ACN，為縮小峰寬，改善峰形，同時減少有機溶劑的使用，采用40%ACN進行過渡。

3.2 色譜條件優(yōu)化

在實驗階段，比較Thermo公司和Waters公司的C18 PAH專用柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），前者無法分離出最后兩種物質（DiP和DhP），后者可以達到較好的分離效果。優(yōu)化洗脫梯度和流速，采用ACN和水為流動相，梯度洗脫。為降低食用油的粘性，適當提高進樣盤的溫度，一般液態(tài)油為40℃，對于半固體油樣可以設為45℃。考察柱溫（25℃～35℃）對分離效果的影響（圖2，在30℃條件下可以達到較好的分離效果。Dip和Dhp在色譜柱上保留較強，在不影響前14種物質分離的條件下，后期加大流速，洗脫最后兩種物質。

3.3 檢測波長的選擇

CCP無熒光，用UV檢測，波長為220 nm；歐盟優(yōu)控的15種PAHs的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長不同，研究者一般采用多通道檢測器，本實驗室儀器無法進行多通道熒光檢測，采用分時間段切換波長，具體見表1。所得15種熒光PAHs的色譜圖見圖3，CPP無熒光性，用紫外檢測器檢測（見圖4）。

3.4 方法學驗證

用IPA配制系列標準溶液，以濃度值為橫坐標，平均峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，測得峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)R2>0.99，在空白油樣中進

圖3 15種PAHs標準混合溶液（8 ng/mL）色譜圖

Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）（8 ng/mL）

圖4 CPP（80 ng/mL）紫外檢測色譜圖

Fig.4 Chromatogram of cyclopenta （c，d） pyrene

（CPP） under UV detection（80 ng/mL）

行低、中、高3個水平加標，每水平重復測定6次，計算回收率和相對標準偏差，回收率為65.25%～110.53%；相對標準偏差為0.1%～9.8%。CPP在UV上響應值較低，3個水平回收率均不高； IcP含5個苯環(huán)結構，但出峰時間較6環(huán)的BgP晚，空間構型比較特殊，可能因其特殊的空間構型導致低濃度時在SPE柱上保留減弱造成回收率較低。本方法具有良好的精密度和準確性。根據(jù)3倍信噪比（S/N）確定LOD，10倍S/N為LOQ，具體見表2。

3.5 實際樣品測定

采用本方法檢測常用的大豆油、葵花籽油等共10種食用油中歐盟優(yōu)控15+1種PAHs的含量，結果見表3。根據(jù)我國和歐盟關于PAHs的限量標準，其中葡萄籽油中BaP超標（>10 μg/kg），葵花籽油、花生油和紫蘇籽油中Bap超過歐盟限量（>2 μg/kg）；葵花籽油、花生油、葡萄籽油和紫蘇籽油中BaA， Chr， BbF和BaP之和>10 μg/kg，不滿足歐盟限量標準；這10種油中均未檢出CPP和DhP。

4 結 論

建立了在線固相萃取技術檢測植物油中15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴的分析方法。通過優(yōu)化在線萃取和分析條件，可以實現(xiàn)15+1種物質的有效分離。本方法與常規(guī)離線方法相比操作簡單，省時省力，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以滿足我國和國際上對PAHs定量分析的要求，并且大大減少了分析時間，可用于日常分析。

References

1 Purcaro G， Moret S， Conte L S. Talanta， 2012， 105： 292-305

2 Moret S， Conte L S. J. Separ. Sci.， 2002， 25： 96-100

3 SCF， Scientific Committee on Food， Opinion of the Scientific Committee on Food on the Risks to Human Health of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Food. 4 December 2002. European Commission （EC）， Brussels， 2002

4 Moret S， Dudine A， Conte L S. J. Am. Oil Chem. Soc.， 2000， 77： 1289-1292

5 Rojo Camargo M C， Antoniolli P R， Vicente E. Food Chem.， 2012， 135： 937-942

6 ZHANG Xiao-Tao， LIU Yu-Lan， WANG Yue-Hua. Chinese J. China Oils and Fats， 2012， 37（10）： 45-49endprint

張小濤， 劉玉蘭， 王月華. 中國油脂， 2012， 37（10）： 45-49

7 GB2762-2012， Maximum Levels for Contaminants in Food. National Standards of the People′s Republic of China

食品中污染物限量. 中華人民共和國國家標準. GB2762-2012

8 GB 2716-2005， Hygienic Standard for Edible Vegetable Oil. National Standards of the People′s Republic of China

食用植物油衛(wèi)生標準. 中華人民共和國國家標準.GB 2716-2005

9 Commission Regulation （EU） No 835/2011. Amending Regulation （EC） No 1881/2006 as Regards Maximum Levels for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Foodstuffs. Official Journal of the European Union， 20118.19

10 Hossain M A， Salehuddin S M. Arabian Journal of Chemistry， 2012， 5： 391-396

11 LI Qing-Ling， XU Xiao-Qin， LEE Sen-Chun， WANG Xiao-Ru. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31（7）： 33-37

李慶玲， 徐曉琴， 黎先春， 王小如. 分析測試學報， 2006， 25（5）： 33-37

12 Barranco A， Alonso-Salces R M， Bakkal A， Berrueta L A， Gallo B， Vicente F， Sarobe M. J. Chromatogr. A， 2003， 988： 33-40

13 WANG Dao-Wei， ZHAO Shi-Ming， JIN Wei， SHEN Qiu-Ying， HU Ping， HUANG Bin， PAN Xue-Jun. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（6）： 861-868

王道瑋， 趙世民， 金 偉， 沈秋瑩， 胡 平， 黃 斌， 潘學軍. 分析化學， 2013， 41（6）： 861-868

14 WANG Feng， ZHANG Zhi-Jie， LIN Hui， CANG Yi-Peng. Chinese J. Food Science， 2014， 35（6）： 142-145

王 峰， 張志杰， 林 慧， 倉義鵬. 食品科學， 2014， 35（6）： 142-145

15 ZHANG Zhi-Wei， ZHU Lin， LIU Hua-Liang， MA Yong-Jian. Chinese J. China Oils and Fats， 2012， 37（3）： 74-77

張志瑋， 朱 琳， 劉華良， 馬永建. 中國油脂， 2012， 37（3）： 74-77

16 Windal I， Boxus L， Hanot V. J. Chromatogr. A， 2008， 1212： 16-22

17 van Stijn F， Kerkhoff M A T， Vandeginste B G M. J. Chromatogr. A， 1996， 750： 263-273

18 BS EN ISO 22959： 2009. Animal andEdible Fats and Oils-Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by On-line Donoracceptor Complex Chromatography and HPLC with Fluorescence Detection. British Standard

19 Barranco A， Alonso-Salces R M， Corta E， Berrueta L A， Gallo B， Vicente F， Sarobe M. Food Chem.， 2004， 86（3）： 465-474endprint