miR-223敲減慢病毒的構(gòu)建

張欣，關(guān)曉慧，王寶利

miR-223敲減慢病毒的構(gòu)建

張欣，關(guān)曉慧，王寶利△

目的構(gòu)建miR-223敲減慢病毒，為進(jìn)一步研究miR-223的功能提供工具。方法采用Invitrogen公司miR-RNAi在線設(shè)計工具，根據(jù)miR-223成熟體序列設(shè)計了一對互補寡核苷酸片段，退火產(chǎn)物連接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體，經(jīng)酶切連入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，構(gòu)建了miR-223敲減慢病毒質(zhì)粒，利用293T細(xì)胞將其包裝成病毒，并感染ST2細(xì)胞，觀察感染效率并用qRT-PCR檢測miR-223成熟體表達(dá)。結(jié)果酶切鑒定及測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了miR-223敲減慢病毒載體，miR-223敲減慢病毒包裝并感染靶細(xì)胞，表達(dá)綠色GFP熒光蛋白的細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的80%～90%，病毒滴度為1×109PFU/mL，感染效率達(dá)90%。感染miR-223敲減慢病毒的細(xì)胞miR-223表達(dá)量（0.31±0.03）低于陰性對照（1.00±0.09），為陰性對照的31%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t= 15.091，P＜0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建了miR-223敲減慢病毒，為進(jìn)一步研究miR-223的功能準(zhǔn)備了條件。

微RNAs；慢病毒屬；RNA干擾；慢病毒源性載體；miR-223

近年來microRNA（miRNA）表達(dá)及功能的研究成為基因治療的新熱點，有望成為繼siRNA后更理想的基因治療調(diào)控表達(dá)策略［1］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于高等真核細(xì)胞中，在胚胎發(fā)育［2］、細(xì)胞增殖與分化［3］、細(xì)胞凋亡［4］、細(xì)胞代謝［5-6］以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］等多種生命活動中發(fā)揮重要作用。miR-223成熟體長度為22個核苷酸（nt），其前體Pre-mir-223為110 nt，成熟體位于其前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′端，miR-223屬于基因間存在的miRNA，位于X染色體，在進(jìn)化中高度保守［8］。研究發(fā)現(xiàn)miR-223與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等過程有關(guān)［9］。目前慢病毒源性載體（len?tivirus based vector，LV）被廣泛用于RNA干擾的研究中，其能將外源基因?qū)氲交蚪M中，為體外難以轉(zhuǎn)染及原代培養(yǎng)的細(xì)胞提供了潛在的傳遞系統(tǒng)。慢病毒是一類免疫缺陷性病毒，也是一類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在感染過程中可以形成前整合復(fù)合體，定位到核孔并進(jìn)入到細(xì)胞核，并穩(wěn)定整合到基因組上。與質(zhì)粒載體相比，慢病毒載體具有將外源基因引入分裂及非分裂細(xì)胞基因組并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢，并具有轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點［10］。因此，慢病毒載體被認(rèn)為是目前進(jìn)行RNA干擾的首選載體。本論文旨在構(gòu)建miR-223敲減慢病毒載體，為進(jìn)一步研究miR-223的功能提供基礎(chǔ)，并為構(gòu)建敲減慢病毒提供方法和工具。

1 材料與方法

1.1材料pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質(zhì)粒（美國Sys?tem Biosciences公司）；pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體（美國Invitrogen公司）；293T細(xì)胞、Stabl3感受態(tài)由本實驗室提供；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、ClaⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ（美國Fermentas公司）；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司；GM easy慢病毒包裝試劑盒（吉滿生物科技公司）；高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Mix（Themo）；引物合成和測序由Invitrogen公司完成。

1.2方法

1.2.1敲減序列的設(shè)計采用Invitrogen公司miR-RNAi在線設(shè)計工具，根據(jù)miR-223成熟體序列設(shè)計一對大部分互補寡核苷酸片段，正義鏈5′-TGCTGTGGGGTATTTGACAAACTGAC AGTTTTGGCCACTGACTGACTGTCAGTTTCAAATACCCCA-3′，反義鏈5′-CCTGTGGGGTATTTGAAACTGACAGTCAGT CAGTGGCCAAAACTGTCAGTTTGTCAAATACCCCAC-3′，其正義鏈前4個堿基5′-TGCT為懸掛末端，斜體部分為miR-223成熟體的互補鏈，中間部分為環(huán)結(jié)構(gòu)，黑體部分為中間缺少2個堿基的成熟體序列。反義鏈除5′端的CCTG為懸掛末端外，其余部分為正義鏈互補序列。每條寡核苷酸用水溶解為50 μmol/L。在0.2 mL EP管中加入等量該對互補寡核苷酸片段，充分混勻后于PCR儀上進(jìn)行退火反應(yīng)：95℃2 min，50℃2 min，3個循環(huán)，最后冷卻至4℃，得到的退火產(chǎn)物為敲減序列。

1.2.2克隆敲減序列連接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體，反應(yīng)體系：敲減序列2 μL，pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體2 μL，10×T4 ligase Buffer 1 μL，T4 ligase（200 U/μL）1 μL，ddH2O 4 μL，16℃連接過夜。用熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取2μL連接產(chǎn)物加入到剛剛解凍的50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴10 min，42℃熱激40 s，立即置于冰上2 min，加300 μL LB培養(yǎng)基，200 r/min、37℃孵育1 h，將預(yù)培養(yǎng)的菌液4 000 r/min離心5 min，棄掉上清，留取100 μL培養(yǎng)基懸浮菌液，均勻涂于LB/壯觀霉素固體培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。于固體培養(yǎng)板上挑取單菌落搖菌過夜，菌液送測序，測序結(jié)果正確的克隆提取質(zhì)粒（命名為pGW-223-mir）。pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP經(jīng)ClaⅠ/SalⅠ雙酶切電泳回收大片段，pGW-223-miR經(jīng)ClaⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳回收小片段，XhoⅠ和SalⅠ為同尾酶，pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體上的ClaⅠ位點經(jīng)誘變得到，位于CMV promoter序列前。用T4 ligase把pGW-223-mir回收小片段及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體回收大片段于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化Stabl3感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜，于固體培養(yǎng)板上挑取單菌落37℃搖菌過夜，提取質(zhì)粒（命名為miR-223 KD LV）。NdeⅠ單酶切鑒定，37℃，15 min。酶切鑒定正確后送測序，測序結(jié)果正確的克隆，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3慢病毒的包裝與濃縮慢病毒包裝前24 h，293T接種至10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時適宜轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h將更換新鮮DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS，不含雙抗），12 mL/10 cm培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染體系：DMEM 1 mL，miR-223 KD LV/pCDH（又命名control LV）10 μg，GM easy Lentiviral Mix 10 μL，HG Transgene Reagent 60 μL。混勻后，室溫放置20 min后，均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，隨后置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染16～20 h后，小心吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，棄于盛有消毒液的廢液杯中，然后加10 mL新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。換液48 h后，吸取細(xì)胞上清液于50 mL離心管，4℃1 000 r/min離心10 min，上清液加入Amicon. Ultra-15濃縮柱中，4 000×g離心25 min，得到約250 μL病毒濃縮液，測定慢病毒滴度。方法如下：轉(zhuǎn)染前，將生長狀態(tài)良好的293T以1×105/mL密度接種至96孔板，100 μL/孔，共10孔。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在1.5 mL無菌EP管中對病毒濃縮液以10倍梯度進(jìn)行倍比稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：10個1.5 mL無菌EP管中各加入90 μL DMEM完全培養(yǎng)基并進(jìn)行編號，向第1個管中加入10 μL病毒濃縮液，混勻后吸取10 μL加入第2個管混勻。依次類推，做10個稀釋度。棄掉96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入稀釋好的病毒液。感染24 h后，每孔更換100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，利于細(xì)胞生長。感染第4天于熒光顯微鏡下觀察各孔含熒光的細(xì)胞數(shù)并收集濃縮后的miR-223敲減慢病毒及其陰性對照感染293T細(xì)胞，上清液濃縮后進(jìn)行滴度測定，于倒置熒光顯微鏡下觀察并計算感染效率，感染效率指熒光細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。

1.2.4miR-223敲減慢病毒效率miR223敲減慢病毒及其陰性對照慢病毒感染ST2細(xì)胞48 h后，用E.Z.N.A.TMmiRNA Kit（OMEGA）提取miRNA，高效率逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GeneCopoe?ia）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，含2× SYBR mix 10 μL，miR-223上下游引物或內(nèi)參照基因U6上下游引物（2 μmol/L）各2 μL，cDNA 3 μL，雙蒸水3 μL，其中引物購自GeneCopoeia公司。實時定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃1 min，（94℃30 s，60℃15 s，72℃15 s）共40個循環(huán)，72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熔解曲線分析證實產(chǎn)物特異性，以U6作為內(nèi)參，待測樣品2-△△CT值表示目的基因相對表達(dá)量［4］（CT是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)一定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；樣品△CT=目的基因CT值-U6CT值），所有實驗重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-223敲減慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建pGW-223-mir重組載體測序正確，miR-223 KD LV重組載體經(jīng)NdeⅠ單酶切，其酶切鑒定及測序結(jié)果均顯示載體構(gòu)建成功，見圖1。重組慢病毒的表達(dá)框包括：CMV Promoter、EmGFP報告基因、5′miRNA flanking region、插入的敲減序列、3′miRNA flanking region和轉(zhuǎn)錄終止序列。

Fig.1NdeⅠenzyme digestion of miR-223 KD LV recombinant vector圖1 miR-223 KD LV重組載體NdeⅠ單酶切鑒定圖（箭頭所示為目的片段）

2.2miR-223敲減慢病毒包裝并感染靶細(xì)胞熒光顯微鏡下可見表達(dá)綠色GFP熒光蛋白的細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的80%～90%，細(xì)胞生長良好，見圖2。

Fig.2The 293T transfected with lentiviral expression plasmids of miR-223 KD LV and control LV（×100）圖2 miR-223 KD LV與control LV慢病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T（×100）

2.3滴度測定病毒滴度為1×109PFU/mL，按照感染復(fù)數(shù)（MOI）=10感染ST2，可見2組細(xì)胞感染效率相似，表達(dá)綠色GFP熒光蛋白的細(xì)胞約為細(xì)胞總數(shù)的90%，見圖3。

Fig.3The ST2 cells infected with lentiviral of miR-223 KD LV and control LV（×100）圖3 miR-223 KD LV與control LV慢病毒感染ST2（×100）

2.4miR223敲減慢病毒效率感染miR-223敲減慢病毒的細(xì)胞miR-223表達(dá)量（0.31±0.03）低于陰性對照（1.00±0.09），為陰性對照的31%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，t=15.091，P＜0.05）。

3 討論

miRNA是一類非編碼的小單鏈RNA，其長度為18～25 nt，它是由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但是并不翻譯成蛋白質(zhì)。在動物細(xì)胞miRNA主要通過與位于靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）的互補序列結(jié)合而阻斷翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，miRNA序列在進(jìn)化中具有高度的保守性，其表達(dá)具有發(fā)育時序性和組織特異性［11］。

本實驗選用了Invitrogen公司設(shè)計的miRNA干擾質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR作為中間載體，它包含的CMV啟動子具有高效持久啟動的特點，并帶有壯觀霉素抗性，便于原核和真核的篩選，并且?guī)в蠩mGFP綠色熒光蛋白，便于對后續(xù)轉(zhuǎn)染效率的觀察。病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高、持續(xù)時間長，并能在哺乳動物各類細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)siRNA，長期抑制基因表達(dá)，這也是病毒作為載體的一大優(yōu)勢。在病毒包裝過程中應(yīng)注意細(xì)胞種植密度、細(xì)胞活力及病毒的收集時機，這些因素都將直接關(guān)系到后期的干擾效果。

在新構(gòu)建的載體中，重組慢病毒的表達(dá)框包含CMV Promoter、EmGFP報告基因、5′miRNA flanking region、插入的敲減序列、3′miRNA flanking region和轉(zhuǎn)錄終止序列。插入的敲減序列的轉(zhuǎn)錄本類似miRNA的莖環(huán)序列，按照miRNA的剪切方式進(jìn)行剪切，類似siRNA的工作模式，通過結(jié)合互補的miR223成熟體，使其不能結(jié)合蛋白而阻斷翻譯。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控β-catenin的Wnt信號通路［12］，miR-223的靶基因及其作用機制需要進(jìn)一步的研究。

為了進(jìn)一步研究miR-223的功能，本實驗中采用慢病毒載體敲減miR-223在細(xì)胞中的表達(dá)，慢病毒的感染效率很高，能達(dá)到90%。qRT-PCR結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，感染miR-223敲減慢病毒的細(xì)胞miR-223表達(dá)顯著下降，為陰性對照組的31%。表明成功構(gòu)建了miR-223敲減慢病毒載體，采用本方法構(gòu)建敲減慢病毒載體，對目的miRNA敲減有效，在miRNA研究中值得應(yīng)用。

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（2014-11-05收稿 2015-03-06修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Establishment of miR-223 knockdown lentivirus

ZHANG Xin，GUAN Xiaohui，WANG Baoli△
Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo construct miR-223 knockdown lentivirus vector and provide a tool for further study of the function of miR-223.MethodsAccording to the Invitrogen miR-RNAi online design tool，a pair of complementary oligo?nucleotides encoding miR-223 mature sequence was designed，annealed and ligated with pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR vec?tor.Then miR-RNAi expression cassette was cut and subcloned into lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vector.The lentiviruses were packaged and titered，and then ST2 cells were infected with viruses.The efficiency of infection was calcu?lated，and the knockdown of endogenous miR-223 was detected by using real-time RT-PCR.ResultsRestriction enzyme digestion and sequencing results showed that miR-223 lentivirus construct was successfully made.Lentivirus that knock?down miR-223 expression packaged and infected of target cells.The expression of GFP green fluorescent protein accounted for 80%-90%and the virus titer was 1×109PFU/mL.The infection efficiency reached 90%.Compared with negative control virus，miR-223 knockdown lentivirus significantly down-regulated the expression of miR-223 in ST2，and was 31%（n=3，t= 15.091，P＜0.05）.ConclusionmiR-223 knockdown lentivirus is successfully made.It provides a tool for further studying the function of miR-223.

microRNAs；lentivirus；RNA interference；lentivirus based vector；miR-223

Q524.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.004

國家自然科學(xué)基金資助項目（81271977，81472040）

天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所、衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室（郵編300070）

張欣（1985），女，助理實驗師，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究

△通訊作者E-mail：bliwang72@163.com