(±)Bay K8644 提高衰老大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的研究

王斯 周翠平 王敬君

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞又稱為骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，其在機(jī)體的骨代謝平衡的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用［1，2］。人體增加和維持骨量的主要細(xì)胞來源即為BMSCs 分化所形成得成骨細(xì)胞，是人體骨骼維持健康的重要因素［1－3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老是與人體的衰老一同發(fā)生發(fā)展的，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的逐漸衰老，其成骨分化的能力開始減弱，骨生成的能力隨之降低，從而導(dǎo)致一系列的骨代謝性疾?。?，5］，如骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis)等［5］。(±)Bay K8644 是一種小分子化合物，是一種特異性的L 型鈣通道激動(dòng)劑，在研究中發(fā)現(xiàn)其能夠通過激活L 型鈣通道從而促進(jìn)細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流［6，7］。我們在小分子化合物的篩選過程中發(fā)現(xiàn)了(±)Bay K8644 對干細(xì)胞干性標(biāo)志物Nanog 的作用，通過(±)Bay K8644 干預(yù)，Nanog 在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的提升。隨后我們進(jìn)行了一系列的相關(guān)研究，來探明(±)Bay K8644 對衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干性以及衰老特征的影響，同時(shí)對BMSC 的分化能力進(jìn)行了相關(guān)的檢測研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 24 月齡健康雌性大鼠(n =8)用于衰老的BMSCs 的分離培養(yǎng)。大鼠購買自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)。

1.1.2 試劑:高糖D-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone，美國)、胎牛血清(Gibco，美國)，青鏈霉素(Coning，美國)，胰蛋白酶(Hyclone，美國)β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C(Merck，美國);(±)Bay K8644(Sigma，美國)、二甲基亞砜(上海第一化學(xué)廠)、β-galactosidase染色試劑盒(Beyond，中國)、堿性磷酸酶活性定量試劑盒(Beyond，中國)、堿性磷酸酶染色試劑盒(建成生物，中國);Trizol reagent(Invitrogen，美國)、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TAKALA，日本)、DEPC 水(碧云天，中國)，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TAKALA，日本);RIPA 細(xì)胞裂解液(BD，美國)，PMSF(Sigma，美國)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(赫特生物，中國)、蛋白上樣緩沖液(loading buffer)(碧云天，中國)、PVDF 膜(0.45nm)(密理博，美國)、SDS-Page凝膠試劑盒、Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液、Tris-Tricine-SDS 轉(zhuǎn)膜緩沖液、牛血清白蛋白、TBS、吐溫20、anti-OCN(Abcam，美國)、ECL 顯色試劑盒(Santa Cruz，美國)。

1.2 衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng):大鼠注射過量1%戊巴比妥鈉麻醉后，斷頸處死。75%乙醇浸泡消毒10 min 后，置于超凈臺(tái)內(nèi)，分離其四肢長骨，剪去長骨兩端并暴露髓腔，使用5 ml 注射器吸取PBS 對髓腔進(jìn)行沖洗，將沖出的骨髓于培養(yǎng)皿中吹打至粉碎，隨后收集組織懸液，1 500 r/min離心10 min，使用含10%胎牛血清1%雙抗的高糖D-MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃含5%二氧化碳的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第三代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞衰老狀態(tài)的檢測:細(xì)胞生長至80%時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并以6×104/孔的密度接種至24 孔培養(yǎng)板(NUNC，美國)內(nèi)培養(yǎng)，在培養(yǎng)12 h 后使用β-gal 染色試劑盒進(jìn)行染色。方法為吸取培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS 洗滌3 次，隨后使用4%多聚甲醛于室溫固定10 min，PBS 洗滌3 次，染色工作液按說明書配置后加入培養(yǎng)板，于37℃無二氧化碳的孵箱過夜。第2 天在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用

1.3.1 最適作用濃度的選定:將(±)Bay K8644 溶于DMSO 內(nèi)，并配置(±)Bay K8644 濃度分別為1×10－6mol/L、1 ×10－7mol/L、1 ×10－8mol/L、1×10－9mol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h 后提取各組細(xì)胞的RNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測目標(biāo)基因Nanog 的表達(dá)。通過對不同濃度作用下，Nanog 表達(dá)的變化來選取最適的作用濃度，并用于后續(xù)的其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測中，細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)和化合物的干預(yù)，在干預(yù)結(jié)束后，使用PBS 洗滌，加入1 ml/孔的Trizol，充分裂解細(xì)胞，并移入1.5 ml EP 管內(nèi)，加入200 μl 氯仿混勻，于4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min 離心15 min，隨后吸取上清液，加入等體積異丙醇混勻后室溫靜置20 min，于4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μl 冰預(yù)冷的無水乙醇，于4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min 離心5 min，吸取上清后，使用DEPC 水20 μl 重懸沉淀。于酶標(biāo)儀中測定獲得的RNA 濃度，并使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行mRNA 的反轉(zhuǎn)錄，每2 毫克的總RNA 用于反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR qPCR Mix 對反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測，選取2 μl 的cDNA 于20 μl 的反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在CFX96 TM Real-Time System(Bio-Rad)中進(jìn)行，每個(gè)PCR 反應(yīng)體系使用2 μl 的cDNA。使用Bio-Rad CFX Manager 對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物使用Primer Express 6.0 基于公開cDNA 序列合成，Actin 作為內(nèi)參，每個(gè)PCR 的反應(yīng)使用3 個(gè)副孔進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 本文所用的引物序列列表

1.3.2 細(xì)胞β-半乳糖苷酶含量的測定:細(xì)胞以6×104/孔接種至24 孔板，接種后24 h 實(shí)驗(yàn)組使用含(±)Bay K8644 濃度為1×10－8mol/L 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，在干預(yù)完成后，使用β-gal 染色試劑盒對干預(yù)后的細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.4 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

1.4.1 Aging-BMSCs 的成骨分化誘導(dǎo):細(xì)胞生長至80%時(shí)，配置含50 μg/ml VC，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10－8mol/L 地塞米松、10%胎牛血清、100 U/ml 青鏈霉素的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。每3 天換液。實(shí)驗(yàn)組加入(±)Bay K8644 進(jìn)行化合物的干預(yù)，對照組加入等體積二甲基亞砜。

1.4.2 細(xì)胞成骨分化潛能的檢測:對細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)的第7 天，分別提取細(xì)胞的mRNA 和總蛋白，對OCN 的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR 檢測和western blot 的檢測。引物序列見表1。在成骨誘導(dǎo)后的第3、7、14 天使用AKP 試劑盒分別對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)活性的測定，在第14 天使用BCIP/NBT 試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行ALP 染色，在誘導(dǎo)的第21 天對細(xì)胞進(jìn)行茜素紅的染色。細(xì)胞總蛋白的提取:吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，pbs 洗滌3 次，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液于冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解，10 min 后使用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，使用移液器置于1.5 ml EP 管內(nèi)，于 4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心5 min，將上清移入新的EP 管中，使用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液，配置濃度為2 μg/μl 的蛋白懸液，于100℃沸水中煮沸10 min 備用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件，使用單因素方差分析進(jìn)行樣本的總體比較，使用SNK 檢驗(yàn)進(jìn)行樣本間的相對比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)選擇健康雌性24 月齡大鼠，取股骨髓腔內(nèi)的骨髓進(jìn)行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)，細(xì)胞呈集落生長，傳代培養(yǎng)，鏡下可見細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密。至第三代細(xì)胞進(jìn)行β-gal 染色，結(jié)果證實(shí)細(xì)胞中有大量的β-gal 陽性細(xì)胞分部，因此可以證實(shí)所獲得的BMSCs 為衰老細(xì)胞，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1 ～2。

圖1 圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的光鏡照片

圖2 對細(xì)胞進(jìn)行β-gal 染色，可見β-gal 陽性細(xì)胞大量分部

2.2 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用我們首先使用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測了在不同濃度的(±)Bay K8644 的作用下，衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Nanog 的表達(dá)的變化。實(shí)時(shí)定量PCR 的結(jié)果表明，在(±)Bay K8644 濃度為1 000 μmol/L 時(shí)，Nanog 的表達(dá)較Control 組出現(xiàn)了降低，而濃度為100 μmol/L和10 μmol/L 時(shí)Nanog 的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的提升，并在10 μmol/L 的作用時(shí)表達(dá)達(dá)到最高。而更低的作用濃度(1 μmol/L)的干預(yù)下，Nanog 的表達(dá)出現(xiàn)了降低。因此我們繼續(xù)選擇10 μmol/L 的濃度來進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。在β-gal 的染色的試驗(yàn)中，我們用10 μmol/L 濃度的(±)Bay K8644 對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行刺激，隨后染色，并使用Image Pro Plus 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞的含量(染色面積/總面積)為(0.36±0.09)明顯低于Control 組(0.85±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2，圖3。

表2 不同濃度(±)Bay K8644 干預(yù)下BMSCs 的Nanog 表達(dá)

圖3 細(xì)胞使用10 μM 的(±)Bay K8644 干預(yù)后β－gal 染色陽性細(xì)胞

2.3 (±)Bay K8644 對Aging－BMSCs 成骨分化能力的影響在成骨誘導(dǎo)第7 天時(shí)對OCN 的表達(dá)進(jìn)行RT－PCR 檢測Control OCN 表達(dá)為(1.00±0.17)，(±)Bay K8644 為(1.75±0.21)，western blot 檢測，并對所得條帶進(jìn)行提及分析Control OCN 表達(dá)為(74.65±13.59)，(±)Bay K8644 為(136.98±21.14)，顯示(±)Bay K8644 明顯促進(jìn)了OCN 在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)(P ＜0.05)。在成骨誘導(dǎo)的第14 天對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，染色結(jié)果顯示，通過(±)Bay K8644 的干預(yù)，(±)Bay K8644 深染細(xì)胞(0.82±0.23)高于Control(0.64±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性出現(xiàn)了明顯的上升。而堿性磷酸酶活性的定量檢測的結(jié)果同樣顯示，實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶活性在第7、14 天時(shí)較Control 組有明顯上升。這一結(jié)果表明(±)Bay K8644 能夠促進(jìn)衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。在成骨誘導(dǎo)的第21 天，對細(xì)胞進(jìn)行了茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，(±)Bay K8644 干預(yù)后的細(xì)胞產(chǎn)生了更多的礦化結(jié)節(jié)為(0.92±0.22)明顯高于Control 的(0.54±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖4 ～6，表3。

圖4 在成骨誘導(dǎo)第7 天時(shí)對OCN 的表達(dá)進(jìn)行western blot 檢測結(jié)果

表3 成骨誘導(dǎo)的第3、7、14 天ALP 的活性 nmol/15 min/mg，±s

表3 成骨誘導(dǎo)的第3、7、14 天ALP 的活性 nmol/15 min/mg，±s

注:與(±)Bay K8644 組比較，*P ＜0.05

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圖5 在成骨誘導(dǎo)第14 天時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色結(jié)果

圖6 在成骨誘導(dǎo)的第21 天進(jìn)行茜素紅染色結(jié)果

3 討論

人體骨的形成及代謝的重要機(jī)制之一即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程［8］。在人體的衰老過程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也隨之衰老，而這一衰老的進(jìn)程直接導(dǎo)致了其向成骨細(xì)胞分化的能力的下降，人體的骨代謝平衡被打破，骨量下降，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展［4，5］。

(±)Bay K8644 是一種鈣離子通道的激動(dòng)劑，由于其能夠特異性地激活L 型鈣離子通道［6］，因此在心律失常、心絞痛以及高血壓等疾病的研究中有較多的應(yīng)用。而鈣離子對于人體具有極為廣泛的作用［9］，鈣離子的活動(dòng)和骨折等骨疾病，以及老年病有著緊密的關(guān)系［10］。我們由此對(±)Bay K8644 與衰老干細(xì)胞之間的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)的探索研究，并證實(shí)了(±)Bay K8644 對衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的潛能有著一定的提升作用。

Nanog 是維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性的重要核外轉(zhuǎn)錄因子［11，12］。而在衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，Nanog 表達(dá)下降，因此其定向分化的能力也隨之減弱［11］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 濃度的(±)Bay K8644 能夠在mRNA 水平明顯提升Nanog 的表達(dá)，和對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的Nanog 表達(dá)提升了2 倍以上，證實(shí)了(±)Bay K8644 對于維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干性(stemness)具有一定的作用。

骨鈣素(Osteocalcin，OCN)是由成骨細(xì)胞(Osteoblasts)所特異性分泌的一種蛋白，骨鈣蛋白在骨礦化時(shí)大量合成，因此被認(rèn)為是成骨分化誘導(dǎo)的標(biāo)記之一［13，14］。在對衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo)過程中，RT-PCR 和western Blot 的結(jié)果顯示(±)Bay K8644 能夠明顯的促進(jìn)衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)OCN 的表達(dá)。

綜上所述，通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，(±)Bay K8644能夠使衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老狀態(tài)得到一定的改善，同時(shí)其成骨分化的潛能得到一定的提升。

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