抗克百威單鏈抗體的可溶性表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

鄧　　龍，王　　弘，周　　思，冼燕萍，郭新東

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量安全研究所，廣東廣州510642；3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110）

抗克百威單鏈抗體的可溶性表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

鄧龍1，2，王弘2，*，周思1，3，冼燕萍3，郭新東3

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520；2.廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量安全研究所，廣東廣州510642；3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110）

為構(gòu)建克百威（carbofuran，CBF）單鏈抗體（scFv）可溶性表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)。以pCANTAB5E-scFv質(zhì)粒為模板擴(kuò)增CBF的重鏈（VH）及輕鏈（VL）片段，通過引物設(shè)計引入由15個氨基酸組成的連接肽（Gly4Ser）3，經(jīng)重疊延伸拼接重鏈及輕鏈片段，并通過PCR擴(kuò)增得到scFv基因，再與載體pLIP6/GN連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定并測序。重組菌經(jīng)0.6 μmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）及低溫誘導(dǎo)表達(dá)重組單鏈抗體，并通過SDS-PAGE和Western blotting對其鑒定。采用ELISA法檢測重組單鏈抗體的抗原結(jié)合活性。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pLIP6/GN-scFv含有插入片段，scFv與堿性磷酸酶（AP）相連得到重組蛋白的分子量接近78 ku，可被游離的CBF競爭性抑制，IC50值為26.80 ng/mL。這說明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pLIP6/GN-scFv并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，為研究其在免疫分析方法中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

克百威，重組單鏈抗體，可溶性表達(dá)

克百威（carbofuran，CBF）是一種高效廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲劑，同時，因其高制毒性及不易降解［1］，容易造成環(huán)境污染［2］，國家農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)中已規(guī)定其在糧食和蔬菜中不得檢出［3］。目前，克百威違法使用的現(xiàn)象依然存在，因而有必要對其進(jìn)行持續(xù)的檢測和監(jiān)管。

克百威殘留常規(guī)的檢測方法包括儀器檢測法［4-6］、免疫分析法［7-12］、電化學(xué)免疫傳感器方法［13-16］等。由于儀器分析方法前處理復(fù)雜，分析過程繁瑣，同時又需要昂貴的儀器和熟練的操作人員，滿足不了大批量樣品的檢測和監(jiān)測分析工作。電化學(xué)免疫傳感器的方法作為一種新的檢測方法，具有選擇性和靈敏度高，響應(yīng)時間短等特點(diǎn)，但是現(xiàn)今的檢測方法仍不能滿足大批量樣品的檢測。免疫分析方法作為一種高通量的初篩方法，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，對于CBF大批量樣品快速檢測，免疫分析方法仍然是首選。作為第三代抗體—基因工程抗體，其具有快速、容易獲得的特點(diǎn)，將所獲得的抗體基因轉(zhuǎn)入到工程菌中進(jìn)行發(fā)酵大量表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)，更加方便其用于實(shí)踐之中。此外，基因工程抗體可對基因序列進(jìn)行分析、修飾、修改以改進(jìn)抗體特性或賦予抗體新的特性，突破以往僅局限于半抗原分子設(shè)計的限制，具有更多的靈活性［17-18］。

pLIP6/GN載體中含有信號肽序列，可將載入蛋白引導(dǎo)至周質(zhì)腔中，進(jìn)而分泌到胞外，實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，同時pLIP6/GN載體還融合了堿性磷酸酶序列，使所表達(dá)的抗體可以進(jìn)行直接競爭ELISA反應(yīng)，因而使檢測變得非常方便、快捷［19-21］。本研究基于前期篩選獲得的抗CBF的重鏈及輕鏈序列，進(jìn)一步開展抗CBF的單鏈抗體（scFv）可溶性表達(dá)研究，并對scFv進(jìn)行抗原結(jié)合活性分析，為建立基于單鏈抗體的CBF免疫分析方法奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

pCANTAB5E-scFv質(zhì)粒［22］（含抗CBF scFv序列）本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌BL21（DE3）playsS本實(shí)驗(yàn)室保存；pLIP6/GN載體Dr.Frédéric Ducancel（Pharmacology and Immunoanalysis Department，CEA/ Saclay，Gif-sur-Yvette，F(xiàn)rance）惠贈；內(nèi)切酶SfiⅠ、NotⅠ、BglⅠ和T4 DNA連接酶及DNA膠回收純化試劑盒TaKaRa公司產(chǎn)品；酵母提取物和蛋白胨Oxoid公司產(chǎn)品；克百威原藥、氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-dthiogalactoside，IPTG）、對硝基苯基磷酸二鈉鹽（pNPP）廣州威佳生物科技公司；質(zhì)粒提取試劑盒廣州英偉創(chuàng)津生物科技有限公司；一抗為鼠抗大腸桿菌AP單抗Sigma公司；培養(yǎng)基2×YT的配方參照分子克隆操作指南［23］。

TH-A-403型雙人水平凈化工作臺A無錫一凈凈化設(shè)備廠；HZ100型恒溫培養(yǎng)搖床、HP400S型生化培養(yǎng)箱A武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；Wellwash MK2洗板機(jī)美國Thermo公司；6K-15高速冷凍離心機(jī)德國Sartorius公司；Wallac VITOR 1420多標(biāo)記分析儀美國PE公司；微量移液器美國Eppendorf公司；PCR引物上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1　PCR引物表Table 1　PCR primers

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pLIP6/GN-scFv的構(gòu)建以質(zhì)粒pCANTAB5E-scFv為模板，分別以VH′B-SfiⅠ和VH′linker，VL′linker和VL′F-NotⅠ為兩組引物，PCR擴(kuò)增VH和VL片段，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：94℃變性5 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，29個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠回收純化。將獲得的VH和VL兩個片段進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為94℃變性5 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，10個循環(huán)；72℃延伸10 min。之后再以所得的拼接產(chǎn)物為模板，以VH′BSfiⅠ，VL′F-NotⅠ為引物，PCR擴(kuò)增全長scFv片段，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為：94℃變性5 min；94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，29個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及凝膠回收純化。獲得的scFv片段和載體pLIP6/GN經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ分步雙酶切后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，抗性（100 μg/mL Amp）篩選重組克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR鑒定后再測序驗(yàn)證。

1.2.2抗CBF scFv的誘導(dǎo)條件優(yōu)化及鑒定

1.2.2.1IPTG濃度的影響挑取scFv的陽性克隆接種于4 mL含Amp的2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，之后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min，培養(yǎng)至A600為0.7～0.8時，加入1 mol/L的IPTG至其終濃度分別為1、0.8、0.6、0.4、0.2 mmol/L，28℃、200 r/min，培養(yǎng)6 h，取培養(yǎng)基上清液10 μL，再加入100 μL pNPP底物顯色液，37℃顯色10 min，測定A405nm光吸收值，檢測堿性磷酸酶活性。

1.2.2.2誘導(dǎo)溫度的影響挑取scFv的陽性克隆接種于4 mL含Amp的2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，之后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min，培養(yǎng)至A600為0.7～0.8時，加入1 mol/L的IPTG至其終濃度為1 mmol/L，分別用28、26、24、22、20℃，200 r/min，培養(yǎng)6 h，取培養(yǎng)基上清液10 μL，再加入100 μL pNPP底物顯色液，37℃顯色10 min，測定A405nm光吸收值，檢測堿性磷酸酶活性。

1.2.2.3誘導(dǎo)時間的影響挑取scFv的陽性克隆接種于4 mL含Amp的2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，之后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min，培養(yǎng)至A600為0.7～0.8時，加入1 mol/L的IPTG至其終濃度為1 mmol/L，24℃、200 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng)6、8、10、12、14 h時，取各誘導(dǎo)時間下的培養(yǎng)基上清液10 μL，再加入100 μL pNPP底物顯色液，37℃顯色10 min，測定A405nm光吸收值，檢測堿性磷酸酶酶活性。

1.2.2.4抗CBF scFv的表達(dá)按照確定的優(yōu)化條件，挑取scFv的陽性克隆，接種于4 mL含Amp的2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，之后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min，培養(yǎng)至A600為0.7～0.8時，加入0.6 mmol/L IPTG，24℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，離心后取培養(yǎng)基上清用12%SDS-PAGE蛋白電泳分析，按照分子克隆操作指南［10］，采用Western blotting對表達(dá)的scFv進(jìn)行鑒定。

1.2.2.5抗CBF scFv的抗原結(jié)合活性測定以CBFOVA為包被抗原，采用直接競爭ELISA法，對融合堿性磷酸酶的scFv（AP-scFv）的抗原結(jié)合活性進(jìn)行鑒定，CBF標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度為0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100 ng/mL。取50 μL CBF標(biāo)準(zhǔn)溶液加到包被好的酶標(biāo)板上，加入等體積用PBS適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)基上清液，混勻。37℃溫育2 h，棄去孔中液體，用PBST洗滌6次，加入100 μL pNPP溶液顯色，測定A405值。

2　結(jié)果與分析

2.1pLIP6/GN-scFv的構(gòu)建

2.1.1CBF-scFv基因的擴(kuò)增以pCANTAB5E-scFv為模板質(zhì)粒，VH′B-SfiⅠ和VH′linker為引物PCR擴(kuò)增得到360 bp的重鏈目的片段，VL′F-NotⅠ和VL′linker為引物PCR擴(kuò)增得到324 bp的輕鏈目的片段（圖1），其大小與預(yù)期相符。將該片段經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切后連入表達(dá)載體pLIP6/GN，得到重組載體pLIP6/GN-scFv。

圖1　PCR擴(kuò)增VL和VH片段Fig.1　Amplification of the heavy and light chains gene

2.1.2pLIP6/GN-scFv的PCR鑒定以pLIP6/GN-scFv為模板進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增得到了約750 bp的全長的scFv目的片段（圖2）。對插入片段進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明該片段確為scFv目的片段。

圖2　重組質(zhì)粒pLIP6/GN-scFv的PCR鑒定Fig.2　Identification of recombinant vector pLIP6/GN-evoscFv

2.2抗CBF scFv的表達(dá)與鑒定

2.2.1SDS-PAGE和Western blotting鑒定SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，以BL21空載體菌體作為對照，表達(dá)產(chǎn)物中（4～6泳道）有一條相對分子質(zhì)量為78 ku的新蛋白條帶（圖3）。Western blotting分析表明，該條帶可與鼠抗堿性磷酸酶單抗發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)（圖4）。

圖3　抗CBFscFv的SDS-PAGE分析鑒定Fig.3　SDS-PAGE analysis of scFv expression

圖4　抗CBFscFv的Western blotting鑒定Fig.4　Western blotting analysis of scFv expression

scFv在原核系統(tǒng)中表達(dá)有兩種方式，一是包涵體表達(dá)，即抗體累積在菌體中，二是分泌表達(dá)，即滯留在周質(zhì)腔中或者穿過外膜直接分泌到胞外。本研究中，通過SDS-PAGE蛋白電泳分析表明，抗CBF scFv-AP的表達(dá)大部分積累于菌體中，即是一種包涵體表達(dá)。因而在表達(dá)條件的選擇上，應(yīng)該有更優(yōu)的組合。據(jù)研究表明，為實(shí)現(xiàn)原核系統(tǒng)的可溶性表達(dá)，隨著IPTG誘導(dǎo)濃度，表達(dá)溫度的降低和誘導(dǎo)時間的延長都會促使可溶性表達(dá)量增加［24］，但是也有條件的限制。IPTG濃度若低過臨界值，則起不到誘導(dǎo)作用。表達(dá)溫度若太低則不利于菌體的生長，而導(dǎo)致分泌表達(dá)量下降，一般認(rèn)為8～10℃為菌體生長的臨界值，因而誘導(dǎo)表達(dá)的溫度不能低于8～10℃［25］。因此，本文通過控制誘導(dǎo)表達(dá)中IPTG誘導(dǎo)濃度、表達(dá)溫度和誘導(dǎo)時間，獲得了IPTG濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為24℃，誘導(dǎo)時間為12 h的較優(yōu)表達(dá)條件（圖5～圖7）。

圖5　IPTG濃度對CBF scFv表達(dá)的影響Fig.5　Effect of IPTG concentration on CBF scFv expression

圖6　誘導(dǎo)溫度對CBF scFv表達(dá)的影響Fig.6　Effect of induction temperature on CBF scFv expression

圖7　誘導(dǎo)時間對CBF scFv表達(dá)的影響Fig.7　Effect of induction time on CBF scFv expression

2.2.2ELISA鑒定以CBF-OVA為包被抗原，采用直接競爭ELISA法對scFv的抗原結(jié)合活性進(jìn)行鑒定。以CBF濃度值為橫坐標(biāo)，以B/B0為縱坐標(biāo)（B為加入不同濃度CBF所測定的A405值，B0為未加CBF的A405值），采用Origin軟件對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，擬合模型為四參數(shù)羅徹斯特模型［26］（4 parameter-logisitic model）。并計算IC50（B/B0=50%時CBF的濃度值）。結(jié)果表明，表達(dá)的單鏈抗體可被游離的CBF競爭性抑制，IC50值為26.80 ng/mL（圖8），這說明scFv具有較好的抗原結(jié)合活性，可用于CBF的檢測。

從理論上講，單鏈抗體和單克隆抗體的特異性應(yīng)該相差不大，據(jù)楊金易等報導(dǎo)［27］，抗克百威單克隆抗體的克百威抑制中濃度IC50為1.18 ng/mL，但本研究中，抗CBF scFv的克百威抑制中濃度IC50為26.80 ng/mL，要高于抗克百威單克隆抗體的IC50值。這可能是因?yàn)橹苯佑每贵w表達(dá)的培養(yǎng)基上清液做ELISA反應(yīng)，培養(yǎng)基上清液中雜蛋白較多，影響了IC50值。

圖8　抗CBF scFv的抑制曲線Fig.8　Inhibition curve of anti-CBF scFv

3　結(jié)論

本研究通過構(gòu)建融合堿性磷酸酶可溶性表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21（DE3）playsS為宿主菌，采用IPTG及低溫誘導(dǎo)，成功實(shí)現(xiàn)了抗CBF單鏈抗體的可溶性表達(dá)。這省去了以往在包涵體表達(dá)載體中的抗體變性及復(fù)性等繁瑣操作，同時也保證了抗體的活性［28］。與此同時，由于抗體與堿性磷酸酶融合，使所表達(dá)的抗體可以進(jìn)行直接競爭ELISA反應(yīng)，因而使檢測變得非常方便、快捷。

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Soluble expression and charaterization of anti-carbofuran single chain Fv

DENG Long1，2，WANG Hong2，*，ZHOU Si1，3，XIAN Yan-ping3，GUO Xin-dong3
（1.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，China）

To express and characterize the soluble anti-carbofuran（CBF）single chain Fv（scFv）.The gene of CBF scFv using plasmid pCANTAB5E-scFv as template，by means of designing the primers which consists of 15 amino acids as the linker peptide（Gly4Ser）3，splicing by overlap extension heavy chain and light chain fragments，was cloned into pLIP6/GN vector to construct the recombinant plasmid pLIP6/GN-scFv.Recombinant plasmid was identified the recombinant plasmid by restrictive enzyme digestion，PCR amplification and sequence analysis.Finally，the recombinant protein was expressed in E.coli BL21，determined by SDS-PAGE and Western blot．ELISA was used to determine the antigenicity of the recombinant protein.The results showed that recombinant plasmid pLIP6/GN-scFv contained the inserted fragment.The expression of scFv linked with alkaline phosphatase showed 78 ku and could competitively combine with CBF，the IC50was 26.80 ng/mL.The scFv of CBF was successful cloned and expressed，which could be useful for corresponding immunoassay methods．

carbofuran；recombinant single-chain antibody；soluble expression.

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.028

2014－09－12

鄧龍（1985-），男，碩士，助教，研究方向：生物工程與食品質(zhì)量安全，E-mail：gdjldl@163.com。

王弘（1973-），女，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量安全，E-mail：gzwhongd@163.com。