ER、PR、MMP-9在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)

高翠嫻范治軍

（1 大連市婦幼保健院，遼寧 大連 116000；2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 大連 116000）

ER、PR、MMP-9在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中的表達(dá)

高翠嫻1范治軍2

（1 大連市婦幼保健院，遼寧 大連 116000；2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 大連 116000）

目的 通過觀察絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中ER、PR、MMP-9的表達(dá)情況，探討子宮內(nèi)膜息肉的相關(guān)發(fā)病機制，并尋找預(yù)測絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉惡變可能的相關(guān)蛋白，指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后。方法 實驗選取的病例標(biāo)本來自我院2013年1月1日至2013年12月31日的手術(shù)患者，其中經(jīng)手術(shù)切取的絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜標(biāo)本18例，經(jīng)宮腔鏡下摘除或?qū)m腔鏡手術(shù)切除的絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉標(biāo)本30例。采用免疫組化法，檢測兩組中ER、PR、MMP-9在組織中的表達(dá)情況。取半定量評分方法，分析兩組中腺體及間質(zhì)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)進行評估。結(jié)果 實驗組與對照組中ER的表達(dá)陽性率分別為93%和78%，ER蛋白在實驗組強陽性表達(dá)情況高于對照組；PR的表達(dá)陽性率分別為87%和67%，PR蛋白在實驗組強陽性表達(dá)情況高于對照組；MMP-9的表達(dá)陽性率分別為33%和11%，MMP-9的陽性表達(dá)呈現(xiàn)弱陽性，且實驗組陽性表達(dá)情況高于對照組。結(jié)論 ER、PR含量升高促使絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生；MMP-9的表達(dá)參與了絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的生成；經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中MMP-9的表達(dá)不能作為子宮內(nèi)膜息肉向子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)。

絕經(jīng)后；內(nèi)膜息肉；ER；PR；MMP-9

子宮內(nèi)膜息肉在絕經(jīng)前、絕經(jīng)后婦女中均可發(fā)生，是比較常見的瘤樣病變，為婦科常見疾病。其發(fā)病率國外文獻報道為7.8%～34.9%，惡變率1.0%～1.6%[1-2]。而在絕經(jīng)后的子宮內(nèi)膜息肉患者中，部分患者發(fā)生了自子宮內(nèi)膜息肉發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)變，其惡變率高達(dá)4.1%[3-4]，目前大多數(shù)研究普遍認(rèn)為體內(nèi)ER、PR表達(dá)水平失衡與子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生密切相關(guān)[5]。ER和PR是配體依賴轉(zhuǎn)錄活性因子超家族的成員。子宮內(nèi)膜中ER的表達(dá)較多，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜的增生以及血管的增殖。雌激素還可以誘導(dǎo)ER和PR的不斷生成，長期過度的作用便可促進子宮內(nèi)膜發(fā)生增生形成息肉，個別甚至發(fā)生癌變。PR與孕激素結(jié)合后在子宮內(nèi)膜中發(fā)揮作用的途徑與和雌激素基本相同?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP），是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，也參與炎癥的發(fā)生及擴散等病理變化。子宮內(nèi)膜息肉上MMP-9的高表達(dá)提示其在絕經(jīng)前后內(nèi)膜息肉的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了一定的作用。MMP-9在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)率逐漸升高，提示MMP-9促進子宮內(nèi)膜癌的進展。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例標(biāo)本：所有病例均為我院2013年1月1日至2013年12月31日收治的患者，所有患者均無體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為肥胖情況，無高血壓病、糖尿病病史，未服用過三苯氧胺類藥物、非甾體抗炎藥，無經(jīng)歷雌孕激素替代治療病史。所有患者年齡、絕經(jīng)時間及孕產(chǎn)次均無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.1.2實驗儀器：4950型石蠟包埋機、Lecia RM2235輪轉(zhuǎn)式組織切片機、DMR+Q550病理圖像分析儀、脫水機、切片機、微波儀、S261型變焦體視顯微鏡、微量電子天平、可調(diào)微量加樣器。

1.1.3實驗試劑：即用型雌激素受體（ER）鼠抗人單克隆抗體、即用型孕激素受體（PR）鼠抗人單克隆抗體、即用型基質(zhì)金屬蛋白酶-9鼠抗人單克隆抗體、DAB顯色劑、檸檬酸抗原修復(fù)液、APES防脫片劑、多聚-L-賴氨酸/PBS粉劑、無水乙醇、丙酮、二甲苯、蘇木精、伊紅。

1.2方法

1.2.1實驗分組：分為對照組和實驗組兩組。對照組包含經(jīng)手術(shù)切取的絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜標(biāo)本18例，所有患者平素身體健康，自然絕經(jīng)后超1年，因子宮脫垂行陰式全子宮切除術(shù)，術(shù)前超聲提示子宮萎縮，內(nèi)膜厚＜5 mm，術(shù)中剖視大體標(biāo)本，見內(nèi)膜光滑，萎縮，術(shù)后病理證實為正常絕經(jīng)后內(nèi)膜?；颊吣挲g為51～74歲，中位年齡為（56±4.81）歲。實驗組包含經(jīng)宮腔鏡下摘除或?qū)m腔鏡手術(shù)切除的絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉標(biāo)本30例，所有患者平素身體健康，自然絕經(jīng)后超1年因陰道排液、流血、下腹痛、常規(guī)體檢超聲提示內(nèi)膜厚≥5 mm，回聲欠均勻，進一步宮腔鏡檢查提示子宮內(nèi)膜息肉，行宮腔鏡下內(nèi)膜息肉摘除術(shù)或?qū)m腔鏡下內(nèi)膜息肉切除術(shù)，病理證實為子宮內(nèi)膜息肉，排除其他內(nèi)膜病變?；颊吣挲g為49～72歲，中位年齡為（54±5.01）歲。

1.2.2實驗方法

1.2.2.1免疫組化標(biāo)本處理：玻片表面涂上一層多聚-L-賴氨酸膠，烤干備用，將各張切片加入含有3%過氧化酶的阻斷劑50 μL，其作用是阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，微波下抗原修復(fù)，加入10%正常兔血清50 μL，加入第一抗體（簡稱一抗，分別為即用性抗ER、PR、MMP-9單抗）50 μL，加入生物素標(biāo)記的第二抗體（兔抗鼠單抗）50 μL，加入SP溶液50 μL，加入新鮮配制的DAB 100 μL，顯色、脫水、中性樹膠封片。

圖1　對照組ER低倍鏡下表達(dá)情況

圖2　對照組ER高倍鏡下表達(dá)情況

圖3　實驗組ER低倍鏡下表達(dá)情況

圖4　實驗組ER高倍鏡下表達(dá)情況

圖5　對照組PR低倍鏡下表達(dá)情況

圖6　對照組PR高倍鏡下表達(dá)情況

圖7　實驗組PR低倍鏡下表達(dá)情況

圖8　實驗組PR高倍鏡下表達(dá)情況

圖9　對照組MMP-9低倍鏡表達(dá)情況

圖10 對照組MMP-9高倍鏡表達(dá)情況

圖11　實驗組MMP-9低倍鏡表達(dá)情況

圖12　實驗組MMP-9高倍鏡表達(dá)情況

1.2.2.2免疫組化法檢測ER、PR、MMP-9的表達(dá)：免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒，其中ER、PR為細(xì)胞核陽性，MMP-9為細(xì)胞質(zhì)陽性，表達(dá)的判定以陽性細(xì)胞的百分率進行評估。

1.2.2.3計分方法：染色結(jié)果觀察采用盲法，由兩位病理科醫(yī)師在不知病理分級和臨床資料的情況下讀片，取半定量評分方法，每張切片隨機選擇5個視野，在全切片的上、下、左、右、中選取視野，在高倍光鏡下（400×）用病理圖像分析系統(tǒng)，根據(jù)視野中的染色情況計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)量，分別測定患者子宮內(nèi)膜息肉及正常絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。每張切片根據(jù)陽性細(xì)胞的百分率分別作出判斷：（-）為未出現(xiàn)反應(yīng)細(xì)胞，（+）為＜25%陽性細(xì)胞，（++）為25%---50%陽性細(xì)胞，（+++）為50%～75%陽性細(xì)胞，（++++）為75%～100%陽性細(xì)胞。

1.2.3統(tǒng)計方法：采用SPSSl9.0軟件包進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用t檢驗和單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為有顯著性差異。

2　結(jié) 果

免疫組化染色觀察及分析：免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒，ER、PR、MMP-9均可表達(dá)于患者子宮內(nèi)膜息肉及正常子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)細(xì)胞中，其中ER、PR表達(dá)于細(xì)胞核，表達(dá)的強弱判定以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率進行評估，MMP-9表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)的強弱判定以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率進行評估。

2.1ER蛋白主要定位于細(xì)胞核，胞質(zhì)少量染色，其在實驗組及對照組中的陽性率分別為93%和78%（t=1.064，P＜0.05），ER蛋白在實驗組強陽性表達(dá)情況高于對照組（P＜0.05）。見圖1～4和表1。

2.2PR蛋白定位于細(xì)胞胞核，實驗組與對照組中PR的表達(dá)陽性率分別為87%和67%（t=1.187，P＜0.05），PR蛋白在實驗組強陽性表達(dá)情況高于對照組（P＜0.05）。見圖5～8和見表2。

表1　ER在兩組中的表達(dá)情況

表2　PR在兩組中的表達(dá)情況

2.3MMP-9主要定位于細(xì)胞質(zhì)實驗組與對照組中MMP-9的表達(dá)陽性率分別為33%和11%（t=1.032，P＜0.05），MMP-97的陽性表達(dá)呈現(xiàn)弱陽性，且實驗組陽性表達(dá)情況高于對照組（P＜0.05）。見圖9～12和表3。

表3　MMP-9在兩組中的表達(dá)情況

3　討 論

子宮內(nèi)膜息肉為婦科常見子宮內(nèi)膜病變，發(fā)病率較高，有研究顯示絕經(jīng)后的患者子宮內(nèi)膜息肉有發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險，該情況的發(fā)生概率較絕經(jīng)前的患者略高。病因及發(fā)病機制目前不明，有報道指出主要是ER、PR在子宮內(nèi)膜的病變中發(fā)揮主要作用，另有其他相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)也起到了促進的作用。

子宮內(nèi)膜息肉惡變的現(xiàn)象在臨床上已經(jīng)引起了廣大婦產(chǎn)科臨床醫(yī)師的高度關(guān)注。國內(nèi)外已經(jīng)有研究表明月經(jīng)狀態(tài)和子宮內(nèi)膜息肉惡變有相關(guān)性，尤其在絕經(jīng)期后，子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生惡變的風(fēng)險有明顯增高趨勢，特別是在＞65歲的人群中。因此對于絕經(jīng)期的子宮內(nèi)膜息肉，明確息肉性質(zhì)，將指導(dǎo)臨床選擇治療的方式及判斷預(yù)后情況。本研究意在通過觀察絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中ER、PR、Ki-67的表達(dá)情況，欲探討子宮內(nèi)膜息肉的相關(guān)發(fā)病機制，并尋找預(yù)測絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉惡變可能的相關(guān)蛋白，利用對蛋白表達(dá)情況的檢測，為臨床工作提供治療方式的選擇，以及由此判斷患者的預(yù)后情況。

ER和PR在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)最多，對子宮內(nèi)膜的影響即表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜的增生和血管增殖，形成息肉[7]。雌激素還可以在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)ER和PR生成，長期過度的作用即可使子宮內(nèi)膜發(fā)生增生，息肉樣改變，部分患者甚至癌變[8]。PR與孕激素結(jié)合后發(fā)生作用的途徑與和雌激素基本相同，但也能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對ER和PR產(chǎn)生下調(diào)，主要是由于使增生期內(nèi)膜轉(zhuǎn)為分泌期，使間質(zhì)細(xì)胞蛻膜改變，促使細(xì)胞發(fā)生了調(diào)亡[9]。一般認(rèn)為，長期的雌激素刺激可能是子宮內(nèi)膜增生的主要發(fā)病因素。子宮內(nèi)膜在長期的持續(xù)過多的雌激素刺激作用下，逐漸發(fā)生了內(nèi)膜增生過長，當(dāng)子宮內(nèi)膜增生過長時，由于長期不排卵而缺乏足夠的孕激素發(fā)揮與之抗衡的作用，就會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生一系列不同程度的增生性改變，促使息肉的形成。有研究發(fā)現(xiàn)從正常內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜、內(nèi)膜癌組織中的ER、PR分布不同[10]。本實驗中所得結(jié)果顯示實驗組比對照組的ER、PR陽性率表達(dá)高，ER、PR蛋白在實驗組強陽性表達(dá)情況高于對照組。提示ER、PR含量升高與絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生密切相關(guān)。雌激素與ER結(jié)合后，可促使子宮內(nèi)膜增生，子宮內(nèi)膜各部分ER含量不同，局部內(nèi)膜受體含量較高時，局部內(nèi)膜增生過盛，便形成息肉。Taylor等[11]研究發(fā)現(xiàn)，息肉ER表達(dá)水平較相應(yīng)的內(nèi)膜明顯升高，推斷ER持續(xù)高水平表達(dá)使細(xì)胞增殖，從而形成息肉。Maia等[12]研究發(fā)現(xiàn)息肉ER無論在腺上皮細(xì)胞還是基質(zhì)中均強陽性表達(dá)。Lydia[13]的研究發(fā)現(xiàn)，孕激素抑制ER生成的作用減弱，導(dǎo)致ER持續(xù)高水平表達(dá)，最終內(nèi)膜細(xì)胞增殖形成息肉，PR可能在此過程中也參與了內(nèi)膜息肉形成的病理過程。高婉麗等[14]研究認(rèn)為PR的表達(dá)被認(rèn)為是雌激素刺激功能型ER產(chǎn)生的。本實驗亦提示ER、PR在絕經(jīng)后子宮內(nèi)膜息肉中的高表達(dá)與眾多實驗結(jié)果相一致。

MMP-9屬于明膠酶B，為內(nèi)源性蛋白水解酶中的一種，是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，也參與炎癥的發(fā)生及擴散等病理變化，與腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡抑制、細(xì)胞免疫抑制等都有十分密切的關(guān)系。Evrim等[15]的研究表明絕經(jīng)前后內(nèi)膜息肉上MMP-9的表達(dá)提示其在絕經(jīng)前后內(nèi)膜息肉的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了一定的作用。曾嫣等[16]研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后正常子宮內(nèi)膜存在MMP-9的表達(dá)，絕經(jīng)后內(nèi)膜息肉與絕經(jīng)后正常內(nèi)膜比較，息肉組中MMP-9表達(dá)顯著高于內(nèi)膜組，提示可能參與了內(nèi)膜息肉的形成。大部分研究證實MMP-9在子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)高度強陽性表達(dá)，并推測MMP的高表達(dá)可使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）及基底膜（BM）降解增強，從而促進子宮內(nèi)膜癌的進展[17]。因為惡性腫瘤對機體造成危害的主要原因在于具有向周圍組織浸潤性生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力，ECM特別是其中的BM是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中必須克服的生理屏障，而MMP-9恰好是幾乎能降解ECM的所有成分的蛋白水解酶，是腫瘤細(xì)胞結(jié)合、溶解細(xì)胞外基質(zhì)，進而經(jīng)溶解缺損處向外轉(zhuǎn)移過程中的限速酶。此外MMP-9還能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽，導(dǎo)致新生血管生成，同時可通過與整合素的相互活化而加強細(xì)胞間的黏附作用，并且被MMP-9降解的ECM蛋白片段能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的增殖、凋亡與遷移。這提示MMP-9參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞遷移、腫瘤生長和血管生成，它的活性與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[18-19]。本實驗中實驗組與對照組中MMP-9的表達(dá)陽性率分別為33%和11%，MMP-9的陽性表達(dá)呈現(xiàn)弱陽性，且實驗組陽性表達(dá)情況高于對照組。提示雖然在子宮內(nèi)膜息肉中MMP-9有所表達(dá)，但由于呈現(xiàn)弱陽性的表達(dá)，未出現(xiàn)上述其他強陽性表現(xiàn)下促使息肉惡性轉(zhuǎn)化的情況，因此MMP-9無法作為子宮內(nèi)膜息肉向子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)。由于本實驗病例數(shù)量有限，實驗結(jié)果還有待于樣本量的增大進一步探索。

[1] Fambrini M，Buccolieroy AM，Bargelli G，et a1.Clinical I utility of liquid2basod cytology for the characterization and management of endometfial polyps in postmenopausal age[J].Int J Gynecol Cancer，2008，18(2):306-311.

[2] 郭東輝.子宮內(nèi)膜息肉的臨床病理分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，1991，26(5):287-289.

[3] Baiocchi G，Manci N，Pazzaglia M，et al.Malignancyin Endometrial Polyps: a 12 Year Experience[J].Am J Obstet Gynecol，2010，65(2):96-97.

[4] Bakour SH，Khan KS，Gupta JK.The risk of premalignant and malignant pathology in endometrial polyps[J].Acta Obstet Gynecol Scand，2000，79:317-320.

[5] 劉小春，馮力民，張華.子宮內(nèi)膜息肉細(xì)胞凋亡及增殖的研究[J].腫瘤研究與臨床，2010，6(22):368-370.

[6] 薛祥，郭偉，公丕軍.COX-2和MMP-9在絕經(jīng)前后子官內(nèi)膜息肉中的表達(dá)及其意義[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，4(34):353-356.

[7] Thomas W，Guillermo toxtolew—luna，Anais Malpica，et a1.Endometrial Hyperplasia and Endometrial cancer[J].Gynecol Cancer Prevent，1996，23(2):411-454.

[8] 趙瑾，林俊，張信美.子宮內(nèi)膜息肉潛在惡變及惡變的危險因素分析[J].浙江醫(yī)學(xué)，2007，29(8):795-797.

[9] Mittal K，Schwartz L，Goswami S，et al.Estrogen and progesterone receptor expression in endometrial polyps[J].Int J Gynecol Pathol，1996，15(4):345-348.

[10] 馮力民，王偉娟，張紅霞，等.宮腔鏡手術(shù)治療子宮內(nèi)膜息肉的臨床分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2003，38(10):611-613.

[11] Taylor LJ，Jackson TL，Reid JQ，et a1.The differential expression of oestrogen receptors，progesterone receptors， Bcl-2 and Ki-67 in endometrial polyps[J].BJOG，2003，110(9):794-798.

[12] Maia H，Maltez A，Athayde C，et al.Proliferation profile of endometrial polyps inpost-menopausalwomen[J].Maturitas，2001，40 (2):273-281.

[13] Lydia J，Taylor，Tracy L，et a1.The differential expression of oestrogen receptors，progesterone receptors，bcl-2 and ki-67 in endometrial polyps[J].Br J Obstet Gynaecol，2003，110(9):794-798.

[14] 高婉麗，馮力民，張銘，等.絕經(jīng)期乳腺癌婦女服用他莫昔芬后子宮內(nèi)膜雌、孕激素受體變化及Ki-67的表達(dá)[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，26(5):600-604.

[15] Evrim E，Guney M，Karahan N，et al.Immunohistochemical expression of MMP2，MMP9 and COX2 in Stage IA malignant polyps of the endometrium[J].Eur J Gynaecol Oncol，2008，29(5):444-449.

[16] 曾嫣，楊祖菁.環(huán)氧和酶-2、基質(zhì)金屬酶-2、9在子宮內(nèi)膜息肉中表達(dá)和相關(guān)性研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，8(30):9-13.

[17] Erdemoglu E，Guney M，Karahan N，et al.Expression of MMP2，MMP9 and COX2 in Premenopausal and postmenopausal endometrial[J].Maruitas，2008，59:268-274.

[18] 陳曉鋒，顧振綸，梁中琴，等.基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究進展[J].中國藥理學(xué)通報，2001，17(3):253.

[19] Jeziorska M.Immunolocalization of the matrix metalloproteases gelatinase B and stromelysin 1 in human endometrium throughout the menstrual cycle[J].J Reprod Fertil，1996，107(1):43-51.

R737.33

B

1671-8194（2015）34-0033-03