皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)

梁俊琴伊力努爾·哈力甫鄒云敏柴 莉普雄明?

皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中Axin1和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)

梁俊琴1，2伊力努爾·哈力甫2鄒云敏2柴 莉2普雄明2?

目的： 檢測皮膚鱗癌組織中Axin1和Cyclin D1mRNA的表達(dá)，探討其與皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法： 采用實時定量PCR方法檢測40例皮膚鱗癌和癌旁組織及40例正常人皮膚中Axin1和Cyclin D1mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果： 皮膚鱗癌組織中Axin1 mRNA表達(dá)＜癌旁組織＜正常皮膚組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達(dá)＞癌旁組織＞正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。皮損病理分化越差，Cyclin D1 mRNA表達(dá)量越高，Axin1 mRNA水平在皮膚鱗癌的病理分級中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論： Cyclin D1和Axin1可能在皮膚鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，尤其是Cyclin D1與腫瘤分化程度相關(guān)。

皮膚鱗癌； Cyclin D1； Axin1； mRNA； 實時定量PCR

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是常見的非黑素瘤性皮膚惡性腫瘤之一，具有侵襲性且易于轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的身體健康與生活質(zhì)量，由此產(chǎn)生的大量社會和醫(yī)療負(fù)擔(dān)不容忽視。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，近年來研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子在CSCC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。1我們采用實時熒光定量RT-PCR（Taqman probe）法檢測Wnt信號通路中負(fù)性調(diào)節(jié)因子Axin 1和下游效應(yīng)分子Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌，癌旁組織和正常皮膚組織中的表達(dá)，探討其臨床意義，為皮膚鱗癌的發(fā)病機(jī)制及早期診斷提供理論依據(jù)。

1　研究對象與方法

1.1研究對象 收集本院皮膚科2012年1月至2014年6月臨床資料完整的皮膚鱗癌患者40例，經(jīng)過臨床及病理活檢確診。按照組織病理分型標(biāo)準(zhǔn)，均為普通型。普通型按照Broders提出的公認(rèn)四級法分為I～I(xiàn)V級；其中I級21例（52.50%）；II級12例（30.00%）；III級7例（17.50%）；未見IV級。其中男21例，女19例，年齡39.4～93.0歲，平均68.91±6.27歲，病程5～187個月，平均19.05±2.10個月。所有患者在近1個月未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，近1周未局部外用藥物治療，且無嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病或伴有其他腫瘤疾病。上述患者取鱗癌腫物及癌旁組織1～2 cm。40例正常人對照組取自整形科手術(shù)切除正常皮膚，兩組年齡和性別的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。上述手術(shù)標(biāo)本切除后放置甲醛溶液固定制作石蠟切片，患者知情且簽署皮膚腫瘤擴(kuò)大切除術(shù)同意書。

1.2引物、試劑及儀器 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑 Prime ScriptTMRT reagent Kit、Perfect Real Time探針法RTPCR全新預(yù)混系統(tǒng)Real MasterMix（Probe）、Onestep PrimeScript RT-PCR Kit（日本TaKaRa公司）、紫外線分光度儀（美國通用電氣公司）、實時定量PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）、熒光定量檢測試劑盒。目的基因及內(nèi)參照GAPDH，RPLPO，ACTB引物由軟件Primer 5.0設(shè)計。

1.3實時定量PCR方法

1.3.1提取總RNA、合成cDNA QIAGEN試劑盒提取細(xì)胞總RNA，RNA純度及濃度均采用紫外線分光光度測定A值，純度為A260/A280=1.8～2.0，濃度為250～1367 mg/L。按cDNA合成，總RNA定量2μL，加入逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明操作。

1.3.2RT-PCR反應(yīng) 實時定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取2 μL cDNA，按照試劑盒制備反應(yīng)體系，離心數(shù)秒，在PCR儀中擴(kuò)增。引物特征見表1，表2。

表1　Axin 1引物特征

表2　CCND1引物特征

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗結(jié)果以ˉx±s表示，3組比較用獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1Axin1 mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá)皮膚鱗癌組織中Axin1 mRNA表達(dá)低于癌旁組織和正常皮膚組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.000；0.003）。癌旁組織中Axin1 mRNA表達(dá)低于正常組織（P值為0.000），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3　Axin1mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá)水平

2.2Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá) 皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織和正常組織，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.000；0.000）。癌旁組織中 Axin1 mRNA表達(dá)高于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4　Cyclin D1mRNA在皮膚鱗癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá)水平

2.3Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌不同病理分級的表達(dá) Axin1 mRNA在皮膚鱗癌不同病理分級的表達(dá)差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。Cyclin D1 mRNA在3種組織病理分級的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CSCC III級＞CSCC II級＞CSCC I級。病理級別越高，分化越差的皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA的表達(dá)量越高，見表5。

表5　Axin1和Cyclin D1mRNA在不同病理分級皮膚鱗癌的表達(dá)

2.4Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織及癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性 Axin1 mRNA在皮膚鱗癌組織中低表達(dá)，Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織中高表達(dá)。但兩者表達(dá)在皮膚鱗癌組織和癌旁組織中無相關(guān)性（rs=0.100，P=0.538；r=0.574，P=0.098），見表6。

表6　Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織及癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.5Axin1和Cyclin D1mRNA在皮膚鱗癌組織的表達(dá)與患者年齡、病程相關(guān)性 經(jīng)過Spearman秩相關(guān)分析Axin1和Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌與患者年齡無關(guān)（P=0.081，P=0.710），與病程長短無關(guān)（rs= 0.053，P=0.692）

3　討論

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma CSCC）是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤，隨著器官移植患者增加，患非黑素瘤皮膚癌和鱗狀細(xì)胞癌的概率明顯增加，是正常人的40～50倍，國外曾經(jīng)報道一系列的心臟移植患者27%死于皮膚癌。2近來研究表明，除了紫外線照射、人乳頭瘤病毒（HPV）感染、免疫抑制、慢性炎癥、癌基因突變等因素。3另外還與一些遺傳及表觀遺傳的因素有關(guān)，越來越多的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在皮膚惡性腫瘤中的作用受到關(guān)注。Wnt/β-catenin信號通路作為經(jīng)典Wnt信號通路可將信號分子通過級聯(lián)方式，由細(xì)胞膜經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，其不僅在胚胎發(fā)育、細(xì)胞再生中起著重要作用，而且其異?；顒优c多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，特別是在鱗癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。4

Axin1是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-3β、結(jié)腸癌抑制因子（APC）構(gòu)成的β-catenin降解復(fù)合物參與調(diào)節(jié)Wnt信號通路。5由于Axin是一種核質(zhì)穿梭蛋白，調(diào)節(jié)β-catenin的核質(zhì)分布，而胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin能夠轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與Wnt的靶基因結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。國內(nèi)報道Axin1在結(jié)腸癌、肝癌、神經(jīng)上皮瘤和髓母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤的錯義突變中均可降低其表達(dá)水平。6本實驗中皮膚鱗癌組織中Axin1mRNA表達(dá)量低于癌旁組織和正常皮膚組織，癌旁組織中Axin1 mRNA表達(dá)量低于正常組織。提示Axin1 mRNA表達(dá)在正常皮膚中，癌旁組織，皮膚鱗癌逐級減少，Axin1的減少或缺失可能受到腫瘤發(fā)生中其他信號通路的調(diào)控，也可能是Axin1本身發(fā)生突變細(xì)胞激活或抑制通路中下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，改變了信號通路導(dǎo)致皮膚鱗癌的發(fā)生發(fā)展。De Robertis等7發(fā)現(xiàn)在檢測出β-catenin異常增高的肝癌或直腸癌細(xì)胞中表達(dá)野生型的Axin會引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而暗示Axin作為癌癥治療靶點的潛在可能性。

Cyclin D作為細(xì)胞周期素中重要成員之一，與多種惡性腫瘤的遺傳易感性有關(guān)，同時Cyclin D作為Wnt信號通路下游效應(yīng)分子，可以通過與細(xì)胞周期素依賴性激酶結(jié)合而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastoma gene Rb gene）的磷酸化，減少了細(xì)胞對外源性有絲分裂的依賴性，加速細(xì)胞增殖，也可以直接作用惡性腫瘤的轉(zhuǎn)錄過程中。8D型周期蛋白分為3個亞型：Cyclin Dl、Cyclin D2、Cyclin D3。Cyclin D1蛋白在腫瘤細(xì)胞周期起正向調(diào)控作用，該蛋白編碼的基因是CCNDl基因，該基因位于1 lq13染色體。Cyclin D1作為G1期細(xì)胞周期素，是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)控點，也是決定細(xì)胞周期的時間即G1向S期轉(zhuǎn)換中起重要作用。Cyclin Dl主要調(diào)節(jié)細(xì)胞從細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)變以促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)Cyclin Dl基因的擴(kuò)增、染色體易位及Cyclin Dl基因多態(tài)性的發(fā)生時，其蛋白過度表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等密切相關(guān)。9在本實驗研究中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 mRNA在正常皮膚組織中、癌旁組織及皮膚鱗癌組織相對表達(dá)量逐漸增加。皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA表達(dá)量明顯高于癌旁組織和正常皮膚組織，癌旁組織中Cyclin D1 mRNA表達(dá)量也高于正常組織。Axin1mRNA在皮膚鱗癌組織中呈低表達(dá)，在正常組織中高表達(dá)；Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌組織中呈高表達(dá)，在正常組織中呈低表達(dá)。兩者表達(dá)在皮膚鱗癌組織和癌旁組織中無相關(guān)性，但此結(jié)果尚不能完全排除Axin1和Cyclin D1在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相互作用參與皮膚鱗癌的發(fā)生。Cyclin D1與Axin1在皮膚鱗癌的發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的惡化中是否具有協(xié)同作用需要進(jìn)一步研究證實。

本實驗研究結(jié)果顯示Axin1的表達(dá)與患者年齡，性別無關(guān)，本實驗中顯示Axin1 mRNA在皮膚鱗癌的低表達(dá)與鱗癌組織病理分級無關(guān)。而Cyclin D1 mRNA在皮膚鱗癌的高表達(dá)與鱗癌組織的病理分級有關(guān)，分化越高皮膚鱗癌的Cyclin D1 mRNA的表達(dá)量相對越高，提示Cyclin D1可能參與了皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程。本實驗研究結(jié)論與Cyclin D1在其他組織的鱗癌表達(dá)情況一致。有證據(jù)顯示Cyclin D1的過度表達(dá)常引起惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)，其表達(dá)不僅與復(fù)發(fā)有關(guān)，還與病變演進(jìn)有關(guān)。

綜上所述，皮膚鱗癌組織中Cyclin D1 mRNA的高表達(dá)或過表達(dá)與Axin1低表達(dá)或表達(dá)缺失提示Axin 1和Cyclin D1在皮膚鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能起一定的作用。兩者可能為皮膚鱗癌的早期診療和預(yù)后判斷提供參考具有重要的臨床指導(dǎo)意義，然而Axin 1和Cyclin D1在皮膚鱗癌中的確切作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索研究。本研究為今后有關(guān)Wnt信號通路是否通過調(diào)節(jié)Axin 1和Cyclin D1而作用于皮膚鱗癌提供部分理論依據(jù)。

1趙辨.中國臨床皮膚病學(xué).南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2009. 1527-1529.

2劉柯，錢麗庭，陳珂.HPV、p16及p53與頭頸部腫瘤患者的預(yù)后分析.中華放射腫瘤學(xué)雜志，2014，23（02）：112-113.

3張衛(wèi)民，高巖.Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組成蛋白與口腔鱗狀細(xì)胞癌的分化和增殖.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，40：491-494.

4王凱，李建遠(yuǎn).Wnt/β-catenin信號通路與發(fā)育和疾病研究進(jìn)展.中國創(chuàng)新醫(yī)學(xué)，2012，9（11）：17-19.

5Nikuseva Marti?T，Pe?ina-Slaus N，Kusec V，et al.Changes of AXIN-1 and beta-catenin in neuroepithelial brain tumors. Pathol Oncol Res，2010，16（1）：75-79.

6 FangWQ，ChenWW，F(xiàn)u AK，etal.Axin directs the amplification and differentiation of intermediate progenitors in the developing cerebral cortex.Neuron，2013，79（4）：665-679.

7 De Robertis A，Mennillo F，RossiM.Human sarcoma growth is sensitive to small-molecule mediated Axin stabilization.PLoS One，2014，9（5）：e97847.

8李峰，陳臨溪.細(xì)胞周期蛋白D與細(xì)胞周期調(diào)控研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊，2005，25（3）：270-273.

9Shen Y，Xu J，Jin J，et al.Cyclin D1 expression in Bowen's disease and cutaneous squamous cell carcinoma.Clin Oncol，2014，2（4）：545-548.

（收稿：2015-04-20 修回：2015-06-14）

·病例報告·

Expressions of Axin1 and Cyclin D1 m RNA in cutaneous squamous cell carcinom a

LIANG Jun-qin，YI Li-nuer，ZHOU Yun-min，et al.Xinjiang medical university 830011；Xinjiang Uygur AutonomousRegion People's Hospital the Dermatology Department，830011

Objective：To detect the expressions of Axin1 and Cyclin D1 mRNA in cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）in order to determine the relationship with the development of CSCC.M ethods：The levels of Axin1 and Cyclin D1mRNA in 40 samples of CSCC，adjacent skin of the CSCC lesions and 40 normal control skin sampleswere detected by real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）.Results：The level of Axin1mRNA in lesions，adjacentskin and normal skin was reduced in a declined order，with significant differences（P＜0.05）and the level of Cyclin D1 mRNA was increased in turn（P＜0.05）.The less differentiated the CSCC was，the higher level of Cyclin D1 mRNA among different pathological grades（P＜0.05），but there was no significant difference in the level of Axin1mRNA among different pathological grades（P＞0.05）.Conclusion：Axin1 and Cyclin D1 in CSCC may play an important role in the development of CSCC，especially Cyclin D1.

cutaneous squamous cell carcinoma；Cyclin D1；Axin1；mRNA；RT-PCR

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2015211C191）

1新疆醫(yī)科大學(xué)，830011

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，830011