分子對接和熒光光譜法研究麥角甾醇與牛血清白蛋白的相互作用

張　蕊，吳超儀，劉　宇，楊樹德，程顯好

（1.山東省食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺　264025；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙　410012）

分子對接和熒光光譜法研究麥角甾醇與牛血清白蛋白的相互作用

張蕊1，吳超儀2，劉宇1，楊樹德1，程顯好1

（1.山東省食用菌技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺264025；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙410012）

用分子熒光光譜實(shí)驗(yàn)法和分子對接理論研究麥角甾醇與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用。熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：麥角甾醇能猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，其猝滅類型為靜態(tài)猝滅；通過考察猝滅過程中熱力學(xué)函數(shù)的變化初步推斷麥角甾醇與BSA的結(jié)合是自發(fā)的熵增過程，驅(qū)動力主要為疏水相互作用。運(yùn)用分子對接技術(shù)研究了麥角甾醇與BSA的相互作用，結(jié)果表明：麥角甾醇與BSA相結(jié)合，主要的作用力類型為疏水相互作用；并獲得了麥角甾醇在BSA中的作用位點(diǎn)，麥角甾醇處在一個疏水性的結(jié)合口袋中，結(jié)合穩(wěn)定性強(qiáng)。熒光光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分子對接的理論結(jié)果總體上一致，說明結(jié)合過程是一個自發(fā)的過程，BSA可以攜帶和運(yùn)輸麥角甾醇，同時從分子對接中獲得了麥角甾醇在BSA中詳細(xì)的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式。

麥角甾醇；牛血清白蛋白；熒光猝滅；分子對接；結(jié)合位點(diǎn)

麥角甾醇是大型真菌中普遍存在的甾體類化合物，分子式C28H44O，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。實(shí)驗(yàn)證實(shí)食藥用菌中的麥角甾醇及其衍生物具有較好的抗腫瘤活性。國外學(xué)者早在1994年就從真姬菇子實(shí)體中分離出麥角甾醇，并發(fā)現(xiàn)它對小鼠皮膚癌有顯著抑制作用［1］；2000年，Yazawa等［2］指出豬苓醇提物中的麥角甾醇對大鼠膀胱癌有很好的治療作用；此后，Zhang等［3］的研究小組相繼從灰樹花菌絲體和楊樹菇子實(shí)體中分離出麥角甾醇，證實(shí)其對環(huán)氧合酶ⅡCOX-2 （在多種惡性腫瘤中高表達(dá)的酶）有抑制作用。國內(nèi)學(xué)者也開展了一系列的研究［4-9］，其中包海鷹課題組系統(tǒng)地研究了蒙古口蘑、簇生沿絲傘等食藥用菌中的麥角甾醇的抗腫瘤活性［10-12］。然而，以上的研究主要集中在麥角甾醇生物活性方面，但其在體內(nèi)的傳輸機(jī)制以及與相關(guān)蛋白的相互作用方面的探討很少。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是血液中的主要成分，能夠攜帶藥物運(yùn)送到身體需要的部位。BSA與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的氨基酸序列非常類似，兩者具有高度同源性（80%）［13］。因此實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)常用BSA代替HAS來研究血清白蛋白與藥物的相互作用。BSA的三維晶體結(jié)構(gòu)如圖2所示，有3 個結(jié)構(gòu)域：siteⅠ、siteⅡ、siteⅢ，每個結(jié)構(gòu)域有兩個亞結(jié)構(gòu)域A和B，以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包含有幾乎所有的疏水性氨基酸，通過疏水作用構(gòu)成疏水性口袋。在圖2中，BSA的結(jié)構(gòu)用灰色帶狀來顯示，其中方框內(nèi)區(qū)域是由分子對接所確定的麥角甾醇的結(jié)合口袋［14］。

圖1　麥角甾醇分子的構(gòu)型Fig.1　Molecular structure of ergosterol

圖2　BSA的三維晶體結(jié)構(gòu)Fig.2　Crystal structure of BSA

當(dāng)藥物進(jìn)入人體后，通過血漿中蛋白的存儲和運(yùn)輸才能到達(dá)受體部位發(fā)揮其藥理作用，因此，研究藥物與蛋白的相互作用，有助于了解藥物在人體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，對于闡明藥物的作用機(jī)制、藥代動力學(xué)以及藥物的毒性等有非常重要的意義［15-16］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用分子熒光光譜和分子對接技術(shù)研究了它們的相互作用機(jī)制，為麥角甾醇的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

牛血清白蛋白美國Sigma公司；麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%）生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris上海善普化工科技有限公司；無水乙醇（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純）上海拜力生物科技有限公司；氯化鈉（分析純）濟(jì)南百博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

Perkin-Elmer LS55型熒光光譜儀美國PerkinElmer公司；CP214電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；PH計上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Merck Millipore超純水系統(tǒng)德國Merck公司。

1.2方法

1.2.1麥角甾醇與BSA相互作用的熒光光譜測定

熒光光譜測定：準(zhǔn)確移取2 mL 1.0×10-7mol/L（以Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）為溶劑，用無水乙醇配制）的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 cm的石英比色皿中，在250～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，在280 nm波長處熒光強(qiáng)度最大，因此選擇280 nm作為激發(fā)波長。

準(zhǔn)確移取2 mL 1.0×10-7mol/L的BSA溶液于1 cm的石英比色皿中，置于恒溫水浴鍋中，用微量進(jìn)樣器逐次加入濃度為1.0×10-7mol/L的麥角甾醇溶液，每次加入的體積為5 μL，累計加入體積小于60 μL，因此可忽略體積效應(yīng)。每次加入麥角甾醇溶液后恒溫5 min（293 K），測定各個樣品300～500 nm的熒光發(fā)射光譜，入射和出射狹縫為10 nm。重復(fù)上述步驟，分別測定303、310 K情況下各樣品300～500 nm的熒光發(fā)射光譜并記錄結(jié)果。

1.2.2麥角甾醇與BSA相互作用的分子對接研究

1.2.2.1麥角甾醇及BSA結(jié)構(gòu)的預(yù)處理

將麥角甾醇的結(jié)構(gòu)通過Gaussian03軟件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用Becke three-parameter Lee-Yang-Parr密度泛函理論在6-31g（d）水平上（表明在6-31G分裂基組基礎(chǔ)上給重原子（C，N，S）添加d函數(shù)）進(jìn)行，以得到最低能量的構(gòu)型，將優(yōu)化好的構(gòu)型用于分子對接操作。BSA的晶體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫中下載（PDB ID CODE：4F5S），選擇其中的A亞基，將這一簡化后的結(jié)構(gòu)用Chimera程序檢查體系的結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基的質(zhì)子化狀態(tài)［17］；最后運(yùn)用GROMACS 3.3.1軟件（www.gromacs.org）進(jìn)行1 000 步的共軛梯度下降法進(jìn)行能量最小化，這一過程中非鍵截取參數(shù)設(shè)置為10 .，能量梯度收斂標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為0.01 kcal/mol［18］；將這一結(jié)構(gòu)作為初始結(jié)構(gòu)（圖2）進(jìn)行分子對接操作。

1.2.2.2分子對接方法研究麥角甾醇與BSA相互作用

采用分子對接軟件AutoDock 4.2（http：//autodock. scripps.edu/）來研究麥角甾醇與BSA的相互作用機(jī)制［19］。能量優(yōu)化后的麥角甾醇與BSA的結(jié)構(gòu)應(yīng)用于分子對接操作。計算時選擇經(jīng)驗(yàn)自由能函數(shù)和遺傳算法。在分子對接過程中保持蛋白分子的剛性結(jié)構(gòu)，麥角甾醇為全柔性，即設(shè)定所有可旋轉(zhuǎn)鍵自由旋轉(zhuǎn)。選取BSA中可能的結(jié)合位點(diǎn)附近適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)文獻(xiàn)選取了7 個可能的結(jié)合位置［14］，用AutoDock 4.2程序進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的掃描，分子對接的格點(diǎn)為72×72×72，格點(diǎn)間距為0.375 .，形成的空間體積為19 683 .3，每次掃描進(jìn)行50 次獨(dú)立的對接操作，對接結(jié)果在0.1 nm的均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）標(biāo)準(zhǔn)下分組；然后選取對接操作次數(shù)最多的分組中結(jié)合能最低的構(gòu)象，分析這一構(gòu)象的合理性，得到麥角甾醇與BSA相互作用的結(jié)合模式。

2　結(jié)果與分析

2.1麥角甾醇與BSA相互作用的熒光光譜

2.1.1麥角甾醇與BSA相互作用的熒光光譜的類型及機(jī)制BSA為內(nèi)源熒光物質(zhì)，其分子中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基都能發(fā)射熒光，主要體現(xiàn)為色氨酸的熒光。圖3為20 ℃時麥角甾醇對BSA內(nèi)源性熒光猝滅圖，固定激發(fā)波長280 nm，固定BSA的濃度，其發(fā)射熒光的強(qiáng)度隨麥角甾醇濃度的增大而有規(guī)律地降低，表明麥角甾醇與BSA發(fā)生了相互作用并能猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，即產(chǎn)生了熒光猝滅。

圖3　麥角甾醇對BSA熒光光譜的影響（20 ℃）Fig.3　Effect of ergosterol on fluorescence spectrum of BSA at 20 ℃

熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，要測定結(jié)合常數(shù)時必須確定熒光猝滅的類型。Stern-Volmer方程（1）和Perrin方程（2）分別用于描述藥物小分子與蛋白質(zhì)動態(tài)和靜態(tài)熒光猝滅過程［20］。

式中：KSV是動態(tài)猝滅常數(shù)；Kq表示擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)；Kb為表觀靜態(tài)結(jié)合常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，本實(shí)驗(yàn)取10-8s。

將獲得的麥角甾醇對BSA的熒光猝滅數(shù)據(jù)結(jié)合濃度［Q］分別作Stern-Volmer擬合和Perrin擬合，得擬合圖4和圖5，獲得KSV和Kb，見表1。

圖4　4　F0/F與Q的Stern-Volmer擬合圖erFig.4　Stern-Volmer plots of ergosterol with BSA at different temperatures

圖5　lgg?。郏‵0-F）//F］與llggQ的Perriinn擬合圖Fig.5　Perrin plots of ergosterol with BSA at different temperatures

分析兩圖并計算得出：Kq值遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散猝滅常數(shù)2.0×10-10L/（mol·s）。由此可以初步證明其過程為靜態(tài)猝滅。再者，由表1可知，隨溫度升高猝滅常數(shù)減小，而若是動態(tài)猝滅，溫度升高將增大擴(kuò)散系數(shù)，導(dǎo)致猝滅常數(shù)增大，因此進(jìn)一步斷定是靜態(tài)猝滅，即溫度升高可引起復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，使猝滅常數(shù)減小，由此可知動態(tài)碰撞不是引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因，麥角甾醇對BSA的猝滅主要是靜態(tài)猝滅［21-22］，溫度對猝滅和結(jié)合常數(shù)的影響很小，說明化合物與蛋白質(zhì)相互作用時形成穩(wěn)定復(fù)合物而不是相互碰撞來實(shí)現(xiàn)熒光猝滅。

表1　麥角甾醇與BSA分子的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 1　Binding constants （Kb） and binding sites （n） of ergosterol with BSAA

麥角甾醇與BSA的相互作用類型為靜態(tài)猝滅，其表觀結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可用靜態(tài)猝滅公式（2）來計算。處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以lg［（F0-F）/F］對lg［Q］作圖可得一直線（圖5），由直線斜率和截距求出麥角甾醇與BSA分子的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見表1。在不同溫度下結(jié)合常數(shù)均比較大，說明麥角甾醇可以被蛋白質(zhì)所貯運(yùn)和運(yùn)輸。溫度對麥角甾醇與BSA的結(jié)合常數(shù)有輕微影響，隨著溫度升高結(jié)合常數(shù)有所降低，但是溫度對藥物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎沒有影響。

2.1.2熒光猝滅過程中熱力學(xué)函數(shù)的變化與作用力類型的判斷

蛋白質(zhì)等生物大分子和活性小分子之間常常借助靜電作用力、疏水作用力、氫鍵、范德華力等非共價作用力形成類似超分子的復(fù)合物。不同小分子與蛋白質(zhì)間的主要作用力類型不一樣，根據(jù)相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，Ross等［23］總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律：若ΔH＞0及ΔS＞0時，主要表現(xiàn)為疏水作用；若ΔH＜0及ΔS＞0，主要表現(xiàn)為靜電作用；ΔH＜0及ΔS＜0，主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華力作用。而對于水溶液中的相互作用，ΔS＞0就可認(rèn)為是疏水作用，通常水溶液中有離子間的靜電作用使得ΔH＜0。小分子與蛋白質(zhì)之間的熱力學(xué)參數(shù)可通過公式（3）～（5）求算，結(jié)果見表2。

式中：K1、K2為不同溫度時麥角甾醇與蛋白的結(jié)合常數(shù)；ΔG為吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH為焓變/（kJ/mol）；ΔS為熵變/（kJ/（mol·K））。

根據(jù)不同溫度下的K值，可求得ΔH、ΔG和ΔS值，結(jié)果見表2。

表2　不同溫度下麥角甾醇與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of the interaction between ergosterol and BSA at different temperatures

由于BSA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以它和小分子結(jié)合時并不是單一的作用力，而是幾種作用力共同作用。麥角甾醇與BSA結(jié)合過程的ΔH＜0，ΔG＜0，ΔS＞0，表明兩者的作用過程是一個熵增加、吉布斯自由能降低的自發(fā)過程。麥角甾醇只有一個親水性的羥基，其余部分均為疏水性，因此麥角甾醇分子自發(fā)嵌入到BSA分子的疏水腔內(nèi)部，該過程ΔS＞0。因?yàn)棣對ΔG的貢獻(xiàn)相對較小，所以熵增加是麥角甾醇與BSA自發(fā)分子作用過程共同的主要驅(qū)動力，即相互作用的主要類型是疏水相互作用。即麥角甾醇與BSA之間以疏水相互作用作用為主，還包括靜電相互作用和偶極-偶極相互作用等。

2.2麥角甾醇與BSA相互作用的分子對接研究

2.2.1麥角甾醇與BSA的作用位點(diǎn)及結(jié)合模式

運(yùn)用分子對接進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)掃描，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇可以與BSA相結(jié)合，并得到了它們的結(jié)合位點(diǎn)，如圖2所示，結(jié)合位點(diǎn)處麥角甾醇都被疏水性殘基包圍在一個疏水性的結(jié)合口袋中，這一結(jié)合口袋正好可以容納麥角甾醇分子，在結(jié)合口袋中麥角甾醇采取最低能量構(gòu)象與BSA結(jié)合。

麥角甾醇分子非極性較強(qiáng)，只有一個極性的羥基在分子的一端，因此結(jié)合時以非極性相互作用為主，即主要以疏水相互作用與BSA相結(jié)合。通過分子對接操作，得到了麥角甾醇與BSA的結(jié)合模式，如圖6所示。將結(jié)合口袋用網(wǎng)格線表示，麥角甾醇分子用球棍模型展示，BSA中與麥角甾醇有強(qiáng)烈疏水相互作用的氨基酸殘基側(cè)鏈用線型顯示。這些相互作用的氨基酸殘基包括9 個非極性的氨基酸，即V575、V551、A527、F501、F506、F508、F550、M547 和L531，還包括T578、K524和Y400這3 個極性氨基酸，但這3 個極性氨基酸與麥角甾醇的相互作用也是通過非極性碳鏈部分的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。因此麥角甾醇被包裹在一個疏水性的結(jié)合口袋中，結(jié)合非常穩(wěn)定。圖7展示了麥角甾醇5 .以內(nèi)氨基酸殘基的疏水性表面，為了強(qiáng)調(diào)疏水性表面，帶狀結(jié)構(gòu)表示蛋白質(zhì)的長鏈，圖中表面顏色從深色到淺色轉(zhuǎn)變表明疏水性逐漸增強(qiáng)親水性逐漸減弱，可以看出麥角甾醇基本處在一個由淺色組成的結(jié)合口袋中，也就是疏水性的結(jié)合口袋，其周圍氨基酸大部分都是疏水性強(qiáng)的氨基酸殘基。圖7中僅僅展示了一側(cè)的疏水表面，其實(shí)在另一側(cè)也是疏水性的，為便于觀察，圖中只顯示了一半的疏水表面。

圖6　麥角甾醇與BSA的相互作用模式及結(jié)合口袋Fig.6　Binding mode and binding pocket of ergosterol on BSA

圖7　麥角甾醇周圍5 .以內(nèi)氨基酸殘基的疏水表面Fig.7　Hydrophobic surface of the surrounding residues within 5 .

2.2.2麥角甾醇與BSA相結(jié)合的能量效應(yīng)

通過分子對接結(jié)果的分析，得到麥角甾醇與BSA相結(jié)合時體系發(fā)生了能量的變化，其中結(jié)合自由能ΔG為-38.14 kJ/mol，說明麥角甾醇與BSA的結(jié)合非常牢固，即麥角甾醇可以通過與BSA的結(jié)合而被輸送到身體的各個部位。而熒光光譜中計算得到的結(jié)合自由能ΔG為-25.72 kJ/mol （293 K），比用分子對接方法得到的ΔG高一些，這可能是因?yàn)榉肿訉硬僮髦?，選取了能量最低的那種結(jié)合模式進(jìn)行分析，這是一種理想的狀態(tài)；而在實(shí)驗(yàn)中，盡管能量最低的結(jié)合最穩(wěn)定，但要每種結(jié)合都達(dá)到最低能量結(jié)合是不可能的，其中會有很多種的結(jié)合模式，當(dāng)然這些結(jié)合模式的能量較理想狀態(tài)高，實(shí)驗(yàn)得到這些復(fù)雜結(jié)合模式所表現(xiàn)的統(tǒng)計結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果較理論計算的結(jié)果高。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用熒光光譜法分析了麥角甾醇與BSA的相互作用，得出了兩者之間發(fā)生熒光靜態(tài)猝滅；通過對兩者結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計算得出麥角甾醇能夠被蛋白質(zhì)貯存和運(yùn)輸；進(jìn)一步計算不同溫度下熱力學(xué)常數(shù)的變化，確定了兩者之間的作用力類型以疏水性相互作用為主，ΔH＜0，ΔG＜0，ΔS＞0，而且結(jié)合自由能較低（-25.72 kJ/mol，293 K）。

應(yīng)用分子對接方法考察了麥角甾醇在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合模式，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇與BSA主要以疏水相互作用結(jié)合在一起，結(jié)合位點(diǎn)處為一疏水性口袋，麥角甾醇周圍主要以疏水性氨基酸殘基為主，該結(jié)合模式非常牢固，結(jié)合自由能為-38.14 kJ/mol，由于在分子對接中僅僅選擇能量最低的那種理想的結(jié)合模式，因此較實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果要低。

由以上結(jié)果可知：分子熒光光譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子對接得到的理論結(jié)果相一致，證實(shí)了麥角甾醇與BSA能夠相互結(jié)合，結(jié)合自由能較低，結(jié)合過程可以自發(fā)進(jìn)行，這樣有利于麥角甾醇在生物體內(nèi)的攜帶和運(yùn)輸，它們之間的相互作用主要為疏水相互作用，結(jié)合空腔為疏水性的結(jié)合口袋。

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Studies on the Interaction of Ergosterol with Bovine Serum Albumin （BSA） by Fluorescence Spectroscopy and Molecular Docking

ZHANG Rui1， WU Chaoyi2， LIU Yu1， YANG Shude1， CHENG Xianhao1
（1. Shandong Key Laboratory of Edible Mushroom Technology， School of Agriculture， Ludong University， Yantai264025， China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan University， Changsha410012， China）

The interaction of ergosterol with bovine serum albumin （BSA） was investigated by fluorescence spectroscopy and molecular docking. The fluorescence spectral results showed that BSA fluorescence was quenched regularly with the addition of ergosterol； the quenching mechanism may be a static fluorescence quenching process； the thermodynamic parameters calculated by Van't Hoff equation indicated the major role of hydrophobic interaction in the binding process. Consistent results were obtained from the molecular docking. Hydrophobic interaction was the major interaction， and the binding site of ergosterol on BSA was in a hydrophobic binding pocket， and the binding was a spontaneous process. In addition， the detailed binding mode of ergosterol and the conformation of the surrounding residues were shown in docking results.

ergosterol； bovine serum albumin （BSA）； fluorescence quenching； molecular docking； binding site

Q548.3

A

1002-6630（2015）23-0038-05

10.7506/spkx1002-6630-201523008

2015-01-08

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200048；31300013）；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家獎勵基金項(xiàng)目（BS2011SW002）

張蕊（1978—），女，副教授，博士，主要從事菌物化學(xué)研究。E-mail：zhlrui@163.com