蛋白酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展

王繼蓮，李明源，陳　蕓

（1.喀什大學(xué) 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什　844006；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾　843300）

蛋白酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展

王繼蓮1，2，李明源1，2，陳蕓1

（1.喀什大學(xué) 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什844006；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300）

蛋白酶在各領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，但其大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)受到諸多因素制約。利用基因工程技術(shù)對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行改良和克隆表達(dá)，開(kāi)發(fā)高產(chǎn)量、高純度、高活力的蛋白酶資源成為研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)蛋白酶的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)與功能、菌種選育等進(jìn)行了概述，同時(shí)分析了蛋白酶基因在原核和真核生物中的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)蛋白酶基因工程的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

蛋白酶；基因工程技術(shù)；克隆表達(dá)

蛋白酶是催化水解蛋白質(zhì)中肽鍵的一類(lèi)酶，是酶學(xué)研究開(kāi)展的較早，也是最為成熟的一種［1-2］。目前，蛋白酶的應(yīng)用已遍及食品、醫(yī)藥化工、洗滌、飼料等領(lǐng)域，生產(chǎn)總值達(dá)到酶制劑市場(chǎng)的65%［3］。與動(dòng)、植物源蛋白酶相比，微生物蛋白酶來(lái)源廣、菌體營(yíng)養(yǎng)要求低、易于培養(yǎng)，更易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。早期對(duì)微生物源蛋白酶的研究較多集中于天然高產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和下游處理技術(shù)等，總體研究水平不高，沒(méi)有真正考慮到大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)的各方面因素。直至20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)建立后，對(duì)蛋白酶分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究才隨之展開(kāi)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶基因的序列分析、克隆與表達(dá)，使規(guī)模化生產(chǎn)成為可能。本文主要對(duì)蛋白酶的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)與產(chǎn)酶菌株的選育進(jìn)行概述，同時(shí)對(duì)蛋白酶基因工程的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1　蛋白酶簡(jiǎn)介

1.1蛋白酶分類(lèi)體系與應(yīng)用

蛋白酶是由多種水解酶組成的復(fù)雜酶系，根據(jù)其活性部位起催化作用的基團(tuán)屬性，可分為4 類(lèi)：1）絲氨酸蛋白酶，以絲氨酸為活性中心，其活性部位都含Ser、His、Asp，如胰蛋白酶，廣泛應(yīng)用于心血管疾病醫(yī)治、真菌基礎(chǔ)性研究等領(lǐng)域［4-5］；2）巰基蛋白酶，其活性中心含巰基（—SH），如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，多用于生物化工（干酪、明膠及生物蛋白的生產(chǎn)）、食品及醫(yī)藥工業(yè)［6］；3）天冬氨酸蛋白酶（又稱(chēng)酸性蛋白酶），酶學(xué)史上最早被記載的蛋白酶，其活性中心由兩個(gè)天冬氨酸殘基所組成，如胃蛋白酶，主要用于食品添加劑、心血管疾病等方面；4）金屬蛋白酶類(lèi)，其活性區(qū)域多含Zn2+、Ca2+、Mg2+等二價(jià)金屬離子，如枯草桿菌中性蛋白酶，其酶活性易受苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）及金屬螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抑制，廣泛用于食品、日用化工及抗腫瘤等藥物和疾病的機(jī)理研究方面［7］。

1.2蛋白酶的結(jié)構(gòu)

雖然蛋白酶在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，其分子結(jié)構(gòu)、大小、功能等差別很大，但各家族蛋白酶仍然保持了一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，擁有較高的序列相似性。絲氨酸蛋白酶在結(jié)構(gòu)上為全β蛋白，其核心結(jié)構(gòu)由C端和N端結(jié)構(gòu)域組成，其中C結(jié)構(gòu)域執(zhí)行催化功能，而N結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與C結(jié)構(gòu)域相配合，共同維持催化中心三聯(lián)體的構(gòu)象穩(wěn)定性和催化活性［8］（圖1）。巰基蛋白酶家族以木瓜蛋白酶研究的最為詳盡，其酶前體中已形成大小相當(dāng)?shù)? 個(gè)結(jié)構(gòu)域，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的裂隙底部是催化位點(diǎn)［9］（圖2）。天冬氨酸蛋白酶多擁有以C2為對(duì)稱(chēng)軸的兩個(gè)雙葉型三級(jí)結(jié)構(gòu)［10］（圖3）。金屬蛋白酶成員均含有一個(gè)穩(wěn)定的基本結(jié)構(gòu)域：N端疏水信號(hào)肽、前肽區(qū)、催化活性區(qū)。尤其在催化活性區(qū)含1 個(gè)或2 個(gè)金屬離子，以Zn2+最多，這是金屬蛋白酶與上述三類(lèi)蛋白酶最大的不同（圖4），多數(shù)動(dòng)物的基質(zhì)金屬蛋白酶中還含有C端的血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域［11］。前肽區(qū)與催化活性區(qū)中的鋅原子相互協(xié)調(diào)，共同維持酶分子的功能穩(wěn)定性，而血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域主要起調(diào)節(jié)酶活性和底物專(zhuān)一性的作用［12］。

圖1　蛋白酶K三維結(jié)構(gòu)Fig.1　Three-dimensional structure of protease K

圖2　木瓜凝乳蛋白酶三維結(jié)構(gòu)Fig.2　Three-dimensional structure of chymopapain

圖3　胃蛋白酶原三維結(jié)構(gòu)Fig.3　Three-dimensional structure of pepsinogen

圖4　金屬蛋白酶三維結(jié)構(gòu)Fig.4　Three-dimensional structure of metalloprotease

1.3高產(chǎn)蛋白酶優(yōu)良菌株的選育

目前，蛋白酶的生產(chǎn)由于酶活性低、生產(chǎn)成本較高等因素限制，尚不能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，直接從天然環(huán)境中選育有高產(chǎn)酶能力的野生菌種，或借助誘變育種、原生質(zhì)體融合等方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行改造、篩選，進(jìn)一步提高酶活，成為研究的一大熱點(diǎn)。

研究者們對(duì)天然高產(chǎn)酶菌株的篩選已從單純的常溫菌擴(kuò)展到篩選某些特殊性質(zhì)的菌株，如高、低溫蛋白酶、堿性蛋白酶等。Bach等［13］從巴西土壤中篩選到一株高產(chǎn)蛋白酶的耐熱、耐堿細(xì)菌菌株，經(jīng)鑒定為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。Kim等［14］自北極陸地分離到一株產(chǎn)低溫蛋白酶的嗜冷菌，經(jīng)鑒定為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）中的一個(gè)種。

誘變育種主要通過(guò)輻射誘變或一些化學(xué)試劑誘發(fā)菌體的遺傳物質(zhì)突變，獲得性狀優(yōu)良的突變株。例如，蔡婉玲等［15］在富含蛋白質(zhì)的場(chǎng)所采樣，對(duì)篩選到的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行紫外誘變后，其酶活力由1 594 U/mL增加到1 845 U/mL，比原始菌株升高16%。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是指通過(guò)人為的方法，將雙親株的細(xì)胞去壁進(jìn)行原生質(zhì)體融合，使其基因組間交換重組獲得穩(wěn)定重組子的過(guò)程。例如，武金霞等［16］將產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株HL和L5進(jìn)行細(xì)胞融合，得到的融合株蛋白酶活力分別比兩親株提高25.6%和19.9%。

2　蛋白酶基因的篩選

隨著分子生物學(xué)手段的進(jìn)步，利用基因操作技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)高效分解基因工程菌，從根本上提高酶的產(chǎn)量和質(zhì)量成為功能酶選育的重點(diǎn)工程。早期的基因工程方法多是利用“鳥(niǎo)槍法”，即以供體菌株的總DNA為研究對(duì)象，進(jìn)行隨機(jī)酶切，構(gòu)建一個(gè)基因文庫(kù)，連接到表達(dá)載體上，導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆，得到蛋白酶基因。隨著基因合成技術(shù)的成熟，目前常用的基因篩選策略主要包括以下幾種：人工合成法，即根據(jù)已克隆到的蛋白酶序列人工合成目的基因；特異性引物擴(kuò)增法，即根據(jù)已克隆到的蛋白酶序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，在相似物種上擴(kuò)增目的基因。李丹等［17］通過(guò)簡(jiǎn)并引物和染色體步移技術(shù)克隆芽孢桿菌（Bacillus sp.）L010的中溫堿性蛋白酶基因，并導(dǎo)入大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進(jìn)行了重組表達(dá)，發(fā)酵液表現(xiàn)出較高的酶活力。

此外，隨著宏基因組（metagenome）概念的提出，蛋白酶基因也可以通過(guò)特異性引物從某一區(qū)域的總基因組DNA中克隆獲得，有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術(shù)的弊端，為開(kāi)發(fā)未培養(yǎng)微生物的蛋白酶基因資源提供新思路［18］。例如對(duì)殺線蟲(chóng)蛋白酶基因的篩選，便可通過(guò)直接從環(huán)境中取樣構(gòu)建宏基因組Fosmid文庫(kù)，設(shè)計(jì)特異性引物克隆蛋白酶基因［19］。

3　蛋白酶基因的克隆表達(dá)

自1985年Jacobs等［20］首次成功克隆出芽孢桿菌Bacillus licheniformis的堿性蛋白酶基因以來(lái)，利用基因工程技術(shù)對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，構(gòu)建高產(chǎn)蛋白酶工程菌成為研究熱點(diǎn)，為菌種選育提供了新途徑。目前已有數(shù)千種蛋白酶基因被克隆表達(dá)，相應(yīng)的DNA及氨基酸序列被共享在美國(guó)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank、日本DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)（DNA Data Bank of Japan，DDBJ）等數(shù)據(jù)平臺(tái)上。

3.1蛋白酶基因在原核生物中的克隆與表達(dá)

3.1.1蛋白酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)

作為第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，大腸桿菌以其分子遺傳學(xué)背景清楚、繁殖速率快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)被發(fā)展成為基因工程研究中應(yīng)用最廣泛和最深入的模式菌株，幾乎所有已克隆的蛋白酶基因都在大腸桿菌中得到表達(dá)［21-22］。尤其進(jìn)入后基因組時(shí)代后，有關(guān)蛋白組學(xué)、基因功能、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)等新課題的開(kāi)展，大腸桿菌更成為基因表達(dá)的最首要工具。目前通用的質(zhì)粒表達(dá)載體主要有pET系列、pUC系列、pGEM系列等，常用受體菌有BL21、JM109、DH5α、JM103等［23］。如李麗華等［24］從海洋球石藻（Emiliania huxley）病毒中通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增絲氨酸蛋白酶SP基因，將其克隆到表達(dá)載體pET32a上，導(dǎo)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)，Western blotting檢測(cè)到重組表達(dá)蛋白分子質(zhì)量約60 kD，能在脫脂牛奶平板上形成水解圈，證實(shí)其具有生物活性。李潔瓊等［25］從單胞菌Collimonas sp. ZL261克隆得到蛋白酶基因capro，并構(gòu)建于表達(dá)載體pUC118上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株，檢測(cè)到目的蛋白具有蛋白酶活性，最適反應(yīng)溫度30 ℃，最佳作用pH值為7。

盡管大腸桿菌是基因表達(dá)的首選，但也存在一些缺憾。在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白易形成包涵體，不利于純化，且不能進(jìn)行翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾［26-27］，最重要的是經(jīng)過(guò)變性復(fù)性過(guò)程重組蛋白往往失去活性，對(duì)此研究者采取了諸多措施。對(duì)于胞質(zhì)內(nèi)蛋白，可將分子伴侶和目的基因共表達(dá)，介導(dǎo)重組蛋白的折疊裝配；或用中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子替代強(qiáng)啟動(dòng)子，減緩易聚集的折疊中間產(chǎn)物的合成速率，進(jìn)而減少包涵體的形成。還可構(gòu)建分泌系統(tǒng)使異源蛋白分泌性表達(dá)，如大腸桿菌素釋放蛋白系統(tǒng)可增加大腸桿菌的通透性，促進(jìn)周質(zhì)蛋白的分泌；構(gòu)建缺乏細(xì)胞壁的L型細(xì)菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)，直接將外源蛋白分泌到胞外。

3.1.2蛋白酶基因在其他受體菌中的克隆表達(dá)

為優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)質(zhì)量，人們不斷嘗試構(gòu)建新的表達(dá)系統(tǒng)，目前已有一些蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和變鉛青鏈霉菌中得到有效表達(dá)。楊春暉等［28］通過(guò)交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）技術(shù)克隆了一株短小芽孢桿菌的蛋白酶基因啟動(dòng)子序列，分析其與該基因表達(dá)有關(guān)的序列全長(zhǎng)390 bp，構(gòu)建的重組大腸桿菌-芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒pSUBpWApQ3在枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌中均得到表達(dá)，最高酶活力分別達(dá)到466.5 U/mL和3 060 U/mL。馬騰博等［29］從灰色鏈霉菌中克隆胰蛋白酶編碼基因sprT，以pIJ86為載體，成功實(shí)現(xiàn)了其在重組變鉛青鏈霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT的高活性表達(dá)，該重組酶同牛胰蛋白酶（bovine trypsin，BT）相比，耐酸性更強(qiáng)，對(duì)酰胺鍵的特異性更高。

枯草芽孢桿菌是一種食品級(jí)安全菌株，安全系數(shù)更高，可將重組蛋白以可溶形式分泌到胞外，發(fā)酵工藝技術(shù)也較為成熟。不足之處在于自身會(huì)分泌一些具有較強(qiáng)水解活性的蛋白酶，質(zhì)粒本身的不穩(wěn)定造成克隆效率低［30］。應(yīng)對(duì)策略有構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)分泌載體，目前研究比較清楚的有葡萄糖和蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，不僅可以誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，而且可以促進(jìn)外源蛋白的分泌。還可使用枯草芽孢桿菌整合載體，相對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性等。鏈霉菌作為受體菌，致病性較小，但操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)化頻率不高，與之對(duì)應(yīng)的用于基因表達(dá)的啟動(dòng)子和載體也較少。因此，鏈霉菌作為一種有效的表達(dá)工具仍需不斷豐富和完善。

3.2蛋白酶基因在真核生物中的克隆與表達(dá)

真核表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)用于表達(dá)重組蛋白的一種新興表達(dá)體系。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源蛋白的正確折疊、組裝等，是生產(chǎn)具有生物活性蛋白的又一理想選擇。目前常用的真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要有酵母、昆蟲(chóng)及哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞等。

3.2.1蛋白酶基因在酵母中的克隆與表達(dá)

作為一種單細(xì)胞真菌，酵母營(yíng)養(yǎng)要求低，在釀酒和食品行業(yè)的應(yīng)用歷史悠久，是被應(yīng)用最早的微生物，安全性相比原核生物表達(dá)系統(tǒng)更可靠。此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)重組蛋白的水平也較高，又能對(duì)其進(jìn)行正確地折疊、組裝，已發(fā)展成為應(yīng)用最普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)［31］。如柯野等［32］采用PCR技術(shù)擴(kuò)增米曲霉中的堿性蛋白酶基因，將其克隆到表達(dá)載體pPIC9K，電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母KM71，在10 L發(fā)酵罐中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后酶活力為4 100 U/mL，其最適溫度和pH值分別為50 ℃和8.5～9.5。Porres等［33］將枯草桿菌Bacillus licheniformis PWD-1的kerA基因克隆到表達(dá)載體pPICZαA和pGAPZαA上，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X-33實(shí)現(xiàn)外源表達(dá)，最高酶活力為285 U/mL。

通過(guò)對(duì)外源基因、分泌信號(hào)及培養(yǎng)條件的控制等，已有很多異源蛋白成功在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。缺陷在于缺乏高效的啟動(dòng)子，對(duì)外源蛋白的表達(dá)過(guò)度糖基化，增殖過(guò)程中代謝產(chǎn)物的富集會(huì)限制菌群自身的高密度培養(yǎng)。此外，細(xì)胞所分泌的蛋白酶對(duì)自身蛋白的降解，也在很大程度上限制了外源基因的表達(dá)［34］。應(yīng)對(duì)策略包括選擇有高分泌效率的信號(hào)肽，如酸性磷酸脂酶、α因子信號(hào)肽的宿主菌，促進(jìn)外源蛋白的分泌；使用重復(fù)序列作為整合質(zhì)粒的重組位點(diǎn)，增加目的基因的拷貝數(shù)，進(jìn)而提高外源基因的表達(dá)水平；改變培養(yǎng)基的發(fā)酵條件（pH值、溫度等）或使用蛋白酶抑制劑降低蛋白酶活性，增加重組產(chǎn)物的積累。

3.2.2蛋白酶基因在霉菌及動(dòng)物細(xì)胞中的克隆與表達(dá)

霉菌以其較強(qiáng)的外泌蛋白能力及其翻譯后加工，較酵母更類(lèi)似于真核細(xì)胞生物等特點(diǎn)成為表達(dá)外源蛋白的又一理想選擇［35］。如潘力等［36］以米曲霉淀粉酶的強(qiáng)啟動(dòng)子（amyB）和糖苷酶的強(qiáng)終止子（agdA）為基本元件，將泡盛曲霉Aspergillus awamori的酸性蛋白酶基因pepA克隆至農(nóng)桿菌雙元載體phGW中，導(dǎo)入泡盛曲霉宿主菌中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化與表達(dá)，傳代培養(yǎng)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化子的抗藥穩(wěn)定性，培養(yǎng)液酶活力較野生型提高15%。于寒穎等［37］通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體pGT21M-HIS，使捕食線蟲(chóng)真菌Dactylellina cionopapa中與侵染機(jī)制相關(guān)的蛋白酶基因PrD I成功在黑曲霉201中轉(zhuǎn)錄，表達(dá)的外源蛋白分子質(zhì)量約45 kD，在酸性條件下有活性。

此外，動(dòng)物細(xì)胞具有易被轉(zhuǎn)染、分泌物易被純化，且遺傳性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，成為表達(dá)外源蛋白的另一重要途徑，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物已有部分應(yīng)用于生物制品行業(yè)。例如，曾錚等［38］采用PCR擴(kuò)增獲得銅綠假單胞菌SP-6的彈性蛋白酶基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-His-Ela，和親本病毒BacPAK6共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞株Sf21，細(xì)胞在感毒120 h后產(chǎn)酶量達(dá)到最高峰，為20.9 U/mL。楊曉嬌等［39］利用PCR技術(shù)擴(kuò)增微小隱孢子蟲(chóng)類(lèi)的鈣調(diào)蛋白蛋白基因CML，插入到載體pMD18-T中構(gòu)建重組質(zhì)粒，連接到真核表達(dá)載體pVAX1上轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Western blotting和間接免疫熒光法檢測(cè)表明表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量約為25 ku，具有反應(yīng)原性。

4　結(jié) 語(yǔ)

雖然近年來(lái)蛋白酶基因的克隆與表達(dá)研究已取得重要進(jìn)展，但由于多數(shù)異源表達(dá)的重組蛋白分泌較弱、酶活性較低及安全性有待進(jìn)一步驗(yàn)證等問(wèn)題使其工業(yè)化進(jìn)程緩慢。國(guó)內(nèi)已經(jīng)投入工業(yè)生產(chǎn)的菌株（地衣芽孢桿菌2709和C1213及短小芽孢桿菌289、209等）酶活力在18 000 U/mL左右，與國(guó)外的25 000～30 000 U/mL相比仍存在不少差距。因此，繼續(xù)對(duì)原始產(chǎn)酶菌株進(jìn)行定向或非定向性改造，提高菌種的產(chǎn)酶活力，改變產(chǎn)酶性質(zhì)，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求仍是未來(lái)酶工程的發(fā)展趨勢(shì)。在今后的研究工作中，產(chǎn)蛋白酶優(yōu)良菌株的選育仍顯得十分必要；另一方面，除了在常見(jiàn)的宿主中表達(dá)蛋白酶外，需努力嘗試構(gòu)建新的表達(dá)系統(tǒng)或多個(gè)蛋白酶基因共表達(dá)系統(tǒng)，為蛋白酶構(gòu)建更多的表達(dá)載體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其不同組分的有效表達(dá)并進(jìn)一步提高表達(dá)量、酶活性和酶穩(wěn)定性。相信隨著現(xiàn)代生物基因工程的不斷發(fā)展，將會(huì)有更多的蛋白酶基因被克隆表達(dá)，蛋白酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用前景也會(huì)越來(lái)越廣闊。

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Progress in Cloning and Expression of Protease Genes

WANG Jilian1，2， LI Mingyuan1，2， CHEN Yun1
（1. Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashgar University， Kashgar844006， China； 2. Xinjiang Production & Construction Crops， Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin， Alaer843300，China）

Although proteases are widely applied in various fi elds， large-scale industrial application of proteases has been restricted by many factors. Genetic engineering technology has been used for the cloning and expression of protease genes to obtain the protease resources with high quality， high purity and high activity. The classifi cation， structures and functions of proteases， and strain screening for protease production are reviewed in this article. Meanwhile， the cloning， and prokaryotic and eukaryotic expression of protease genes are discussed. Moreover， the future development in protease gene engineering technology is also prospected.

protease； genetic engineering technology； cloning and expression

Q786

A

1002-6630（2015）23-0377-05

10.7506/spkx1002-6630-201523067

2015-01-08

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（BRYB1302）；喀什大學(xué)校內(nèi)青年專(zhuān)項(xiàng)課題（（14）2526）

王繼蓮（1986—），女，講師，碩士，主要從事基礎(chǔ)酶工程研究。E-mail：wjilian0710@sina.com