MS-275對胃腺癌細(xì)胞抑制作用及其機制研究

王棟，宮衛(wèi)東，黃辭，李中華，劉振堂，吳智群

MS-275對胃腺癌細(xì)胞抑制作用及其機制研究

王棟，宮衛(wèi)東，黃辭，李中華，劉振堂，吳智群

目的采用分子靶向藥物治療胃癌是近年研究熱點。探討組蛋白去乙酰化酶抑制因子MS-275通過多種途徑選擇性殺傷人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901的機制。方法10～100 μmol/L藥物濃度梯度的MS-275分別與SGC-7901、人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1共培養(yǎng)24 h后，采用WST-1法檢測SGC-7901及GES-1細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測分析SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位變化，Western blot、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTQ-PCR）分別檢測處理后胃癌細(xì)胞中p21、p27、p57、cyclin B1、cyclin D1基因及相應(yīng)蛋白表達情況。結(jié)果MS-275可使SGC-7901細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），其作用隨藥物濃度增大更明顯，對GES-1細(xì)胞無顯著影響；MS-275可降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位（P＜0.05）；MS-275顯著提升p21、p27、p57基因及相應(yīng)蛋白相對含量，同時降低cyclin B1、cyclin D1基因及其蛋白相對含量（P＜0.05）。結(jié)論MS-275可選擇性殺傷胃腺癌細(xì)胞SGC-7901，這一作用可能是通過線粒體凋亡途徑及調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白表達實現(xiàn)的。

MS-275；胃腺癌；SGC-7901；線粒體凋亡；細(xì)胞周期阻滯

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率很高［1］。胃癌發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種因素、多個病理過程。研究表明，胃癌發(fā)生與核小體核心組蛋白N端賴氨酸殘基乙?；腿ヒ阴；Ш庥兄芮嘘P(guān)系［2］。組蛋白去乙?；敢种埔蜃樱℉DACi）通過調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和去乙?；?，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并且對正常組織的不良反應(yīng)較?。?-5］。MS-275系人工合成的苯甲酰胺類HDACi，前期研究表明其對胃腺癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，但具體機制尚不十分清楚［6-7］。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，深入探究MS-275對人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901選擇性殺傷的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物中心提供，MS-275購自德國Merck公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，WST-1試劑盒及ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京泛博生物技術(shù)公司，所用PCR引物購自北京奧科鼎盛生物科技有限公司。

1.2SGC-7901、GES-1細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，GES-1細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所有細(xì)胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，鋪滿培養(yǎng)瓶底面積85%以上即可傳代，傳代時PBS緩沖液洗滌3次，0.25%胰酶消化1 min，一般按1∶3傳代。

1.3細(xì)胞存活率檢測

分別取對數(shù)生長期GES-1和SGC-7901細(xì)胞，用胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，以1×105/ml細(xì)胞濃度接種于96孔板（每孔100 μl，實驗組），以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對照（對照組），培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞充分貼壁，加入MS-275，終濃度分別設(shè)置為10、20、40、60、80 μmol/L，每個濃度3個平行孔；對照組不加MS-275。培養(yǎng)24 h后取出，每孔加入10 μl WST-1檢測液，37℃溫箱中溫育4 h后酶標(biāo)儀450 nm測定吸光值（D），空白對照孔調(diào)零后根據(jù)吸光值結(jié)果計算腫瘤細(xì)胞存活率：腫瘤細(xì)胞存活率（%）=D實驗組/D對照組×100%。

1.4線粒體膜電位檢測

分別取SGC-7901細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，用20～80 μmol/L MS-275作用24 h，PBS緩沖液洗滌2次后，按照J(rèn)C-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作。用流式細(xì)胞儀進行分析，JC-1單體和聚合物熒光信號分別在FL1和FL2探測器上獲得，F(xiàn)L1-H、FL2-H分別代表綠色熒光強度和紅色熒光強度。

1.5Western blot檢測p21、p27等蛋白表達

用三去污試劑從SGC-7901細(xì)胞中提取總蛋白，分別采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對p21、p27、p57、cyclin B1、cyclin D1進行分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛奶室溫下?lián)u動封閉后加入一抗，4℃過夜；室溫下洗膜后加入二抗，用ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測

采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后作實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTQPCR）檢測，并分析檢測結(jié)果；對待測樣品目的基因進行定量，并用管家基因GAPDH進行校正。基因擴增引物及條件見表1。

表1　基因擴增引物及條件

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間兩兩比較用單向方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MS-275可選擇性降低SGC-7901細(xì)胞存活率

WST-1檢測結(jié)果顯示，實驗組HDACi MS-275能夠明顯降低人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901存活率，且這種作用具有濃度依賴性，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然而，在相同條件下，人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1存活率并未隨MS-275濃度升高出現(xiàn)明顯降低（P＞0.05）（圖1）。MS-275對SGC-7901細(xì)胞作用24 h的IC50約為80 μmol/L。

2.2MS-275可降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位

線粒體膜電位變化用流式細(xì)胞儀和JC-1試劑盒進行檢測。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（Δψm）的理想熒光探針。線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光；線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可產(chǎn)生綠色熒光。由圖2可看出，實驗組紅色熒光強度與綠色熒光強度比值較對照組降低，且具有濃度依賴性，說明MS-275降低了SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位；但在MS-275濃度為80μmol/L時，線粒體膜電位出現(xiàn)升高。2.3MS-275對SGC-7901細(xì)胞周期的影響

圖1　MS-275對不同細(xì)胞生存率的影響

圖2　流式細(xì)胞儀分析MS-275對SGC-7901細(xì)胞體膜電位的影響

Western blot檢測顯示，MS-275能不同程度地上調(diào)SGC-7901細(xì)胞周期p21、p27、p57蛋白表達，同時下調(diào)cyclin B1、cyclin D1蛋白表達（圖3）。

2.4MS-275對腫瘤相關(guān)基因mRNA水平的影響

隨著MS-275作用濃度增高，p21、p27及p57相對含量逐漸升高，cyclin B1、cyclin D1相對含量逐漸降低（圖4），各數(shù)據(jù)間均有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3　MS-275處理24 h后SGC-7901細(xì)胞中腫瘤相關(guān)蛋白表達變化

3　討論

MS-275作為一種人工合成的苯甲酰胺類HDACi，可通過抑制組蛋白去乙?；富钚?，使靶細(xì)胞內(nèi)組蛋白高度乙?；?，從而使細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，并通過影響多種特異性基因表達調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑，發(fā)揮腫瘤殺傷作用［8-9］。前期大量實驗證明，MS-275的腫瘤殺傷作用具有選擇性，即它可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長，而對正常細(xì)胞沒有影響［10-11］。

圖4　MS-275對SGC-7901細(xì)胞中腫瘤相關(guān)基因表達的影響

我們課題組前期研究證實，MS-275可明顯抑制人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901增殖，并具有時間及劑量依賴性，但對人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-l和張氏肝細(xì)胞株卻沒有致凋亡作用，即MS-275對胃癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用［6］；實驗結(jié)果顯示，MS-275濃度在1～8 μmol/L范圍內(nèi)作用24 h，胃癌細(xì)胞存活率雖有下降，但并不具有顯著性差異；細(xì)胞存活率實驗證明，將MS-275濃度調(diào)至10 μmol/ L作用24 h，胃癌細(xì)胞存活率為64.50%，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，隨著藥物濃度逐漸增高，細(xì)胞存活率不斷下降，在80 μmol/L時細(xì)胞存活率降至49.79%，說明MS-275對SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)不斷增強。為此，我們在本研究中將MS-275濃度范圍提升至10～100 μmol/L。

我們通過檢測MS-275作用前后線粒體膜電位變化發(fā)現(xiàn)，MS-275可使SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位下降，且這種作用具有濃度依賴性，提示MS-275經(jīng)由線粒體途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。這與Meng等［12］報道HDACi制滴菌素A（trichostatin A，TSA）對結(jié)腸直腸癌的作用，Rosato等［13］報道MS-275對白血病細(xì)胞的作用相一致。但MS-275在作用濃度為80 μmol/L時，線粒體膜電位出現(xiàn)了升高，這可能與高濃度MS-275對SGC-7901的直接毒性作用有關(guān)。

我們前期研究表明，MS-275具有阻滯細(xì)胞周期的作用，可誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞停滯于G1/S期［6］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，MS-275能顯著增加SGC-7901細(xì)胞內(nèi)p21、p27及p57蛋白量，同時降低cyclin B1、cyclin D1蛋白量；RTQ-PCR檢測顯示MS-275提高了p21、p27及p57基因的相對含量，同時降低了cyclin B1、cyclin D1的相對含量，且作用均具有濃度依賴性。p21、p27、p57、cyclin B1及cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞生長、分化、衰老及死亡過程，同時與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。p21、p27及p57同屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI），可通過抑制cyclin-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性來調(diào)控細(xì)胞周期，并可直接結(jié)合增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抑制細(xì)胞DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G1期，阻止細(xì)胞周期分裂［14］。cyclin B1、cyclin D1基因是重要的原癌基因，它們的蛋白產(chǎn)物分別在G2/M期和G1早期發(fā)揮促細(xì)胞增殖的正向調(diào)控作用［15］。MS-275作用后p21、p27、p57基因及它們的蛋白表達產(chǎn)物相對含量提高，提示MS-275通過上調(diào)CDKI使SGC-7901細(xì)胞停滯于G1/S期，從而發(fā)揮殺傷作用。同時，MS-275可通過下調(diào)cyclin B1、cyclin D1抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。這與Zhou等［16］報道HDACi辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）及丁酸鈉（SB）對成熟神經(jīng)干細(xì)胞的作用，吳偉琪等［17］報道HDACi TSA對胃癌細(xì)胞的作用相一致。

綜上所述，MS-275可通過線粒體凋亡途徑及調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達發(fā)揮對人胃低分化腺癌細(xì)胞株SGC-7901的生長抑制作用及選擇性殺傷作用。MS-275對人胃低分化腺癌細(xì)胞的作用機制復(fù)雜，尚需進行后續(xù)實驗深入研究。進一步揭示MS-275抗胃癌機制，有利于為胃癌治療提供新途徑。

［1］Thrumurthy SG，Chaudry MA，Hochhauser D，et al.The diagnosis and management of gastric cancer［J］.BMJ，2013，347:f6367.

［2］Sun WJ，Zhou X，Zheng JH，et al.Histone acetyltransferases and deacetylases:molecular and clinical implications to gastrointestinal carcinogenesis［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44:80-91.

［3］Bose P，Dai Y，Grant S.Histone deacetylase inhibitor（HDACI）mechanisms of action:Emerging insights［J］.Pharmacol Ther，2014，143:323-336.

［4］Ververis K，Hiong A，Karagiannis TC，et al.Histone deacetylase inhibitors（HDACIs）:multitargeted anticancer agents［J］.Biologics，2013，7:47-60.

［5］Batty N，Malouf GG，Issa JP.Histone deacetylase inhibitors as anti-neoplastic agents［J］.Cancer Lett，2009，280:192-200.

［6］劉瑾，任亞蟬，吳智群.組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275在體外抑制胃癌細(xì)胞的實驗研究［J］.中國癌癥雜志，2011，21：585-588.

［7］Zhang Y，Adachi M，Zhao X，et al.Histone deacetylase inhibitors FK228，N-（2-aminophenyl）-4-［N-（pyridin-3-yl-metho-xycarbonyl）amino-methyl］benzamide and m-carboxycinnamic acid bishydroxamide augment radiation-induced cell death in gastrointestinal adenocarcinoma cells［J］.Int J Cancer，2004，110:301-308.

［8］Bose P，Dai Y，Grant S.Histone deacetylase inhibitor（HDACI）mechanisms of action:emerging insights［J］.Pharmacol Ther，2014，143:323-336.

［9］Hess-Stumpp H，Bracker TU，Henderson D，et al.MS-275，a potent orally available inhibitor of histone deacetylases:the development of an anticancer agent［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39:1388-1405.

［10］Baradari V，H?pfner M，Huether A，et al.Histone deacetylase inhibitor MS-275 alone or combined with bortezomib or sorafenib exhibits strong antiproliferative action in human cholangiocarcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2007，13:4458-4466.

［11］Larsson C.Epigenetic aspects on therapy development for gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors［J］.Neuroendocrinology，2013，97:19-25.

［12］Meng J，Zhang HH，Zhou CX，et al.The histone deacetylase inhibitor trichostatin A induces cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cells via p53-dependent and-independent pathways［J］.Oncol Rep，2012，28:384-388.

［13］Rosato RR，Almenara JA，Grant S.The histone deacetylase inhibitor MS-275 promotes differentiation or apoptosis in human leukemia cells through a process regulated by generation of reactive oxygen species and induction of p21CIP1/WAF1 1［J］. Cancer Res，2003，63:3637-3645.

［14］Bonelli P，Tuccillo FM，Borrelli A，et al.CDK/CCN and CDKI alterations for cancer prognosis and therapeutic predictivity［J］. Biomed Res Int，2014:361020.

［15］Mani S，Wang CG，Wu KM，et al.Cyclin-dependent kinase inhibitors:novel anticancer agents［J］.Expert Opin Investig Drugs，2000，9:1849-1870.

［16］Zhou Q，Dalgard CL，Wynder C，et al.Histone deacetylase inhibitors SAHA and sodium butyrate block G1-to-S cell cycle progression in neurosphere formation by adult subventricular cells［J］.BMC Neurosci，2011，12:50.

［17］吳偉琪，施敏，王玉剛，等.曲古霉素A對人胃癌細(xì)胞的抑制作用及其機制探討［J］.胃腸病學(xué)，2013，18：143-148.

Inhibitory effect of MS-275 on gastric glandular cancer cells and its possible mechanism

WANGDong，GONG Wei-dong，HUANG Ci，LI Zhong-hua，LIU Zhen-tang，WU Zhi-qun.Department of Interventional Radiology，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an，Shaanxi Province 710038，China

WU Zhi-qun，E-mail：zhiqunwu@aliyun.com

ObjectiveThe use of targeting therapy for the treatment of gastric glandular cancer has been a hot topic in recent years.This study aims to clarify that through what ways the histone deacetylase inhibitor MS-275 completes its selectively killing effect on gastric glandular cancer cell line SGC-7901.Methods SGC-7901 cells and GES-1 cells were respectively cultured for 24h，with（10-100）μmol/L concentrations of MS-275.（1）The survival rate of SGC-7901 cells，GES-1 cells and the normal cells were analyzed by WST-1；（2）The change of the mitochondrial membrane potential in SGC-7901 was estimated by flow cytometry；（3）The expression levels of p21，p27，p57，cyclinB1，cyclinD1 were determined by Western blot and PCR methods.Results（1）MS-275 could decrease the survival rate of SGC-7901 cells，the effect was significantly enhanced with the increasing of the concentration（P＜0.05），but MS-275 showed no obvious effect on normal gastric mucosa epithelial cells GES-1；（2）MS-275 treatment could decreased the mitochondrial membrane potential of SGC-7901 cells（P＜0.05）；（3）MS-275 treatment could increase the relative contents of p21，p27，p57 genes and their protein and，at the same time，decrease the relative contents of CyclinB1 and CyclinD1（P＜0.05）.ConclusionMS-275 treatment can selectively kill gastric glandular cancer cells SGC-7901 through several possible ways，such as inducing mitochondrial apoptosis and regulating the expression levels of cell cycle-related genes and proteins.（J Intervent Radiol，2015，24：333-337）

MS-275；gastric glandular cancer；SGC-7901；mitochondrial apoptosis；cell-cycle arrest

R735.2

A

1008-794X（2015）-04-0333-05

2014-09-04）

（本文編輯：邊佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.04.014

國家自然科學(xué)基金（30973464）

710038西安第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院介入科

吳智群E-mail：zhiqunwu@aliyun.com